Wirtsspezifität der Gattung Legionella und Etablierung von Dictyostelium discoideum als Wirtsmodell
Bei der Gattung Legionella handelt es sich um aquatische Stäbchenbakterien, die sich intrazellulär in verschiedenen Protozoen vermehren können. Neben der Nutzung des Protozoenwirtes können humanpathogene Legionella-Spezies in den Alveolarmakrophagen des menschlichen Respirationstraktes replizieren. Diese Besiedelung der Lunge kann zu einer atypischen Pneumonie, der Legionärskrankheit, führen. Humanpathogene Vertreter der Gattung Legionella weisen somit ein duales Wirtssystem auf. Die Wirtsspezifität phylogenetisch verschiedener Legionella Spezies wurde bislang nicht systematisch analysiert. Mit Hilfe von Infektionsversuchen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass für unterschiedlichste Legionella Spezies Acanthamoeba castellanii ein gut geeigneter Wirt darstellt. Hartmannella vermiformis und Naegleria gruberi ermöglichen dagegen nur einem eingeschränkten Legionella-Spektrum ein intrazelluläres Wachstum. Die jeweils höchsten Vermehrungsraten zeigten dabei in allen Amöben die Umweltisolate LLAP 10 und L. lytica sowie der humanpathogene Stamm L. pneumophila Corby. Außerdem scheint die Virulenz humanpathogener Legionellen-Spezies korreliert zu sein mit der Nutzung eines breiten Wirtsspektrums. Ciliaten wie Tetrahymena pyriformis sind im Gegensatz zu den Amöben als Wirte nicht so gut geeignet. Im Vergleich zu den Amöben ist sowohl die Anzahl der sich intrazellulär in T. pyriformis replizierenden Legionella-Spezies sowie deren Replikationsrate erniedrigt. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es Dictyostelium discoideum als neues Wirtsmodell zu etablieren. Bei dieser gut erforschten Bodenamöbe stehen zahlreiche molekularbiologische Methoden für das Manipulieren des Genoms zur Verfügung. Somit ist es möglich, die während einer Infektion benötigten Wirtsfaktoren von Seiten der Amöbe näher zu untersuchen. Mittels Infektionsversuchen sowie fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Methoden konnte die intrazelluläre Replikation von LLAP 10, L. lytica und L. pneumophila in D. discoideum gezeigt werden. Für L. pneumophila konnte durch FACS-Analyse festgestellt werden, dass Bakterien dieser Legionella-Spezies genauso wie in den bisher untersuchten Wirtszellesystemen zu Beginn der Infektion in einem nicht angesäuerten Kompartiment vorliegen. Für alle weiteren verwendeten Legionella Spezies sowie hitzeabgetötete L. pneumophila und die Futterbakterien Klebsiella aerogenes konnte dagegen eine Ansäuerung des Phagosoms nachgewiesen werden. Kolokalisierungsstudien des lysosomalen Markers DdLIMP mit Legionellen bestätigte außerdem eine Inhibierung der Phagolysosomfusion bei L. pneumophila, nicht jedoch bei der sich nicht replizierenden Spezies L. hackeliae. Die Untersuchung einer spezifischen Profilin-minus Dictyostelium-Mutante offenbarte eine erhöhte Phagozytoserate von Legionellen durch die Wirtszellen. Daraus resultierte auch eine leicht gesteigerte intrazelluläre Vermehrungsrate dieser Bakterien. Profilin ist ein Aktin-bindendes Protein und an der Regulation von Aufnahmeprozessen beteiligt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung Bakterien-haltiger Phagosomen aus D. discoideum etabliert. Die magnetische Reinigung von Phagosomen über paramagnetische, Bakterien-konjugierte Beads erwies sich als nicht praktikabel. Die daraufhin entwickelte Anreicherung der Phagosomen über Dichtegradienten-Zentrifugation erforderte jedoch zusätzlich die Eliminierung kontaminierender Lysosomen und Mitochondrien. Die Analyse des phagosomalen Proteoms erfolgte mittels Messung von Enzymaktivitäten und Western-Blotting-Experimenten. Dabei konnten keine quantitativen Unterschiede typischer lysosomaler Marker zwischen gereiften und ungereiften Phagosomen mit lebenden bzw. toten L. pneumophila detektiert werden. Ebenso verlief der Vergleich von ungereiften LLAP 10-haltigen Phagosomen und gereiften Klebsiella-haltigen Phagosomen. Dagegen zeigte die 2D-Gelelektrophorese des phagosomalen Proteoms vier Proteine, die in Phagosomen mit toten L. pneumophila Corby stärker exprimiert waren als in Phagosomen mit lebenden Legionellen. Weiterhin wurde ein Protein detektiert, das für Phagosomen, die lebende L. pneumophila Bakterien beinhalten, spezifisch ist. Dabei könnte es sich um einen von L. pneumophila zur Replikationsvakuole rekrutierten Wirtsfaktor handeln.
Legionella, Dictyostelium, Wirtsspezifität, Phagosomen, host specificity, phagosoms
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