Molekularbiologische Untersuchungen zur Eignung Virulenz-relevanter Faktoren als Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika gegen Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus–Stämmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika können zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. Gängige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre Überlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu überprüfen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden phänotypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenität in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die ∆clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeinträchtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte hämolytische Aktivität sowie eine verminderte Adhärenz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erhöhte autolytische Aktivität in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erhöhte Invasivität im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der ∆clpP-Mutante durch Einführung eines clpP-Expressionsvektors führte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Veränderung in der Genexpression (15 % aller Gene). Eine computerunterstützte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene führte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivität in Abhängigkeit zu veränderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten führte zu einer gesteigerten hämolytischen Aktivität, einer erhöhten Adhärenz an Polystyren sowie einer erhöhten autolytischen Aktivität in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der stationären Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 % und in der stationären Phase 15 % der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Veränderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder hämolytischen Aktivität auf. In einem Infektionsmodell in Ratten führte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis für den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war für eine eindeutige Klärung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeinträchtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt.
Staphylococcus aureus, Antibiotikum, Virulenz, Transkriptom, antibiotics, virulence, transcriptome
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