Struktur- und Funktionsanalysen an BMP Ligand-Rezeptor-Komplexen
Für BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembranärer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinität und Spezifität gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage für das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis für die Affinität und Spezifität dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Auflösung von 1,9Å ermittelt. Mit der höheren Auflösung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Brückenbindungen in der Interaktionsfläche zwischen BMP-2 und BR-IAec möglich. Deren zentrale Bedeutung für dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse bestätigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfläche liegenden Wasserstoff-Brückenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Brücke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Darüber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Prä-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermoleküle für die Anpassung der Bindungsfläche an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für ein neues Modell zur Beschreibung von Affinität und Spezifität der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Brückenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, während die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfläche die Bildung von Wasserstoff-Brückenbindungen energetisch begünstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringfügigen Einfluss auf die Affinität nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Präparation und Kristallisation von binären Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der ternären Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellulären Domänen der hierfür verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abhängigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinitäten ermittelt werden konnten. In Übereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex präpariert. Des Weiteren konnte die Bildung des ternären BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in Lösung nachgewiesen werden. Für all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualität der erhaltenen Kristalle nicht für eine Aufklärung der Struktur aus. Für eine detailliertes Verständnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgeführt werden. Die präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass über die Kenntnis der einzelnen Affinitäten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe möglich ist.
Bone Morphogenetic Protein, Ligand-Rezeptor Komplex, Kristallstrukturanalyse, Wasserstoffbrückenbindung, Hauptbindungsdeterminante, ligand-receptor complex, crystal structure analysis, hydrogen bonds, main binding determinant
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