Analyse polymorpher Sequenzbereiche des Promotors des Humanen Cystein-Reichen Proteins 61 (hCYR61/CCN1)
Analyse polymorpher Sequenzbereiche des Promotors des Humanen Cystein-Reichen Proteins 61 (hCYR61/CCN1) Ziel ist es den Promotor des Wachstumsfaktor und 1,25-Dihydroxy Vitamin D3 regulierten immediate early Genproduktes von Osteoblasten und Signalmolekül im Mikroenvironment des Knochens, hCYR61/CCN1, funktionell zu charakterisieren. Zum ersten sollten 4 unterschiedliche hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte, mit den Längen von 200bp-1000bp auf ihre Promotoraktivität getestet werden, um so eine Vorstellung der Regulationsmechanismen des hCYR61/CCN1 Promotors zu gewinnen. Die andere Fragestellung befasste sich mit der Relevanz eines CA-Repeat Polymorphismus innerhalb des hCYR61/CCN1 Promotors, der anhand einer Gesundenpopulation nachgewiesen worden war. Das Interesse war hierbei, ob unterschiedliche CA-Repeat Längen in einem hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukt von 450bp Länge auch unterschiedliche Promotoraktivitäten erzeugen. Die hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte der Länge 200bp-1000bp wurden mittels PCR eines Templates (J23219 aus einer Lambda Phagendatenbank) hergestellt. Die Länge und die Sequenz der Promotorkonstrukte überprüften wir durch Sequenzierung und Fragmentanalysen. Ausgewählte hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte wurden daraufhin in ein Luziferase-Vektor-System kloniert. Die entstandenen hCYR61/CCN1 Promotor-Vektorkonstrukte wurden in zwei Zellsyteme, h-fob Zellen (humane Osteoblaten) und T/C28a2 Zellen (humane Chondrozyten) durch Elektroporation transfiziert. Die Zellen wurden über 48h kultiviert, geerntet und die Promotoraktivität in einem Luminometer in Fluoreszenz Units (FU) gemessen. Es wurden zwei verschiedene Kultivierungsbedingungen der beiden Zelllinien geprüft, nämlich eine serumfreie und eine serumhaltige, um einen in der Literatur beschriebenen Seruminduktionseffekt nachweisen und überprüfen zu können. Insgesamt wurden für die hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte der Länge 200bp-1000bp Experimente in h-fob Zellen und T/C28a2 Zellen, jeweils unter serumfreien und serumhaltigen Bedingungen durchgeführt. Für die 450bp langen hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte mit den variierenden CA-Repeats von 17-22 CA-Repeats, wurden ebenso Transfektionsexperimente in beiden Zelllinien und unter beiden Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Als Ergebnisse ist zusammengefasst festzuhalten, dass ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukten unterschiedlicher Länge von 200bp-1000bp und ihrem Promotoraktivitätsniveau besteht. Die hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte der Länge 200bp-800bp besitzen eine sehr hohe basale Promotoraktivität, die um den Faktor 4-5 bei serumfreier Kultivierung über der Hintergrundsaktivität liegt. Die Aktivität des 1000bp Promotorfragmentes ist signifikant niedriger (p=0,024 in h-fob Zellen und p=0,037 für T/C28a2 Zellen bei serumhaltiger wie serumfreier Kultivierung), als die der übrigen Promotorfragmente, die sich untereinander nicht signifikant in ihren Aktivitäten unterscheiden (p=0,57 in h-fob Zellen und p=0,66 für T/C28a2 Zellen bei serumfreire Kultivierung). Es besteht weiterhin ein signifikanter Seruminduktionseffekt, der für alle Konstrukte und beide Zelllinien nachzuweisen ist. Dieser ist bei den hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukten der Länge 200bp-1000bp, ebenso wie bei den hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte 450bp mit den variablen 17-22 CA-Repeats nachweisbar (p=0,001 in h-fob Zellen und p=0,002 für T/C28a2 Zellen). Der Seruminduktionseffekt ist für alle Konstrukte proportional und wirkt signifikant stärker auf die T/C28a2 Zellen, als auf die h-fob Zellen. So liegt die durchschnittliche Steigerung der hCYR61/CCN1 Promotoraktivität etwa bei dem Faktor 1,5-3 in h-fob Zellen, in T/C28a2 Zellen jedoch um den Faktor 8-11. Dieser Effekt wirkt auf den Promotor von hCYR61/CCN1, da die basale Hintergrundsaktivität gemessen anhand der Transfektion des leeren Expressionsvektors pgl3-Baisc, davon unbeeinflusst bleibt. Es besteht kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den CA-Repeat Polymorphismen 17-22 CA-Repeats in dem hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukt der Länge 450bp und deren Promotoraktivitäten (p=0,495 in h-fob Zellen und p=0,514 für T/C28a2 Zellen bei serumfreier Kultivierung und p=0,397 in h-fob Zellen und p=0,488 für T/C28a2 Zellen bei serumhaltiger Kultivierung). Die Konstrukte haben also unabhängig von der Zahl der CA-Repeats keine unterschiedliche Promotoraktivität gemessen im Luziferase Assay. Somit lässt sich in diesem in vitro System kein relevanter Effekt hinsichtlich der funktionellen Relevanz diese CA-Repeat Polymorphismus nachweisen. Weitere Experimente werden Auskunft über kausale Regulationsmechanismen des hCYR61/CCN1 Promotors und die Relevanz von hCYR61/CCN1 innerhalb des Knochenstoffwechsels geben.
hCYR61/CCN1 Promotoranalyse, CA-Repeat Polymorphismen, Seruminduktion des hCYR61/CCN1 Promotors, Genregulation, hCYR61/CCN1 promotor, functional characterization of promotor CA-repeat polymorphism activity, Serum inducibility of hCYR61/CCN1 promotor activity
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