Mechanism of Hepatocyte Survival in Experimental Model of Non-Alcoholic Fatty Liver and Antioxidants Intake // Механизъм на хепатоцитно оцеляване при експериментален модел на неалкохолен мастен черен дроб и прием на антиоксиданти

Неалкохолната мастна чернодробна болест(НМЧБ) е най-разпространеното хронично чернодробно заболяване, свързана с нарастващата честота от затлъстяване, захарен диабет тип2, кардиометаболитни заболявания и се смята за неразделна част от метаболитния синдром. НМЧБ е клинико-патологичен синдром със широк спектър от увреждания, които варират от обикновена стеатоза до стеатохепатит, напреднала фиброза и цироза при липса на алкохолна злоупотреба. Неалкохолния стеатохепатит(НСХ) е напреднала форма НМЧБ, който е с необратими по характер увреждания и е най-бързо и стръмно увеличаващата се кохорта на болните-кандидати за чернодробна трансплантация. Конкретните причини и отличителни механизми за прогресията на обикновената стеатоза в НСХ и последващи увреждания не са достатъчно изяснени. Липсват разработени биомаркери, които да регистрират най-ранните алтеративни промени на хепатоцитите при липсващи макроскопски промени за чернодробни увреждания. Важно място в комплекса от рискови фактори заемат ниската двигателна активност, приема на високо-калорични храни и напитки, както и свръхпотреблението на диетична фруктоза. Предполага се, че инсулиновата резистентност, повишената продукция на провъзпалителни цитокини, свободни мастни киселини(СМК) и активни форми на кислорода(АФК) от хипертрофиралата мастната тъкан при затлъстяване, намалението на чернодробната антиоксидантна защита стимулира апоптозата на хепатоцитите и последващи чернодробни увреждания. На базата на тези данни ние създадохме хипотезата, че чернодробната апоптоза е ключов фактор в развитието и прогресирането на НСХ, а оксидативния стрес и възпалението в стеатозния черен дроб се очертават като основни звена в патофизиологичните механизми на клетъчните увреждания и смърт. Нашата цел бе, да се проучат някои възможни механизми на оцеляване на хепатоцитите при експериментален модел на метаболитен синдром с високо-фруктозна диета (ВФД) и прием на антиоксиданти. Въз основа на това си поставихме следните задачи: 1. Да се изследват метаболитните промени при ВФД: телесно тегло и тегло на ретроперитонеална мастна тъкан и черен дроб; нива на серумна глюкоза и липиден профил; нива и съотношение на наситени и ненаситени СМК в чернодробен хомогенат. 2. Да се изследват морфологичните (стеатоза) промени и някои биохимични показатели на чернодробна дисфункция. 3. Да се проучи ролята на оксидативния стрес (нива на МДА-малондиалдехида, редуциран глутатион и глутатион пероксидаза в серуми и чернодробен хомогенат и нискостепенното възпаление (изследване нивата на CRP, TNFa и пикочна киселина) за чернодробното увреждане. 4. Да се изследват апоптотични маркери (серумни- CK18 и тъканни- Bax, Bcl2 и CK18 протеини) при увреждане на черния дроб. 5. Да се проучат корелационни зависимостти между някои показатели на метаболитни нарушения, оксидативен стрес, възпаление и чернодробни увреждания. 6. Да се проучи хепатопротективния ефект на S-AMe(S-аденозилметионин) и Алопуринол при ВФД. За изпълнението на поставените задачи сме изследвали 4 групи мъжки плъхове (линия Wistar): на стандартна диета и 3 групи с ВФД(35% високо-фруктозен царевичен сироп, поставен като разтвор за пиене). 3-тата и 4 тата група са приемали съответно S-AMe и Алопуринол. Използвали сме имонологични, имунохистохимични, хроматографски и биохимични методи на изследване. Статистическата обработка на резултатите в проучването включва дескриптивни методи и аналитични методи (T –test (р ≤ 0.05); вариационен анализ (ANOVA, р<0.05); корелационен аналз (r > 0.5); Регресионен анализ. В настоящата разработка за първи път са проучени основни патофизиологични механизми на чернодробни увреждания свързани със затлъстяването, оксидативния стрес, възпалението и апоптоза при високо-фруктозна диета на плъхове и прием на S-AMе и Алопуринол. Резултатите от проучването доказват, че ВФД предизвиква метаболитни нарушения като затлъстяване, хипергликемия, дислипидемия и хиперурикемия, съответстващи на критериите за диагностика на метаболитния синдром при хора. Това от една страна определя съществената роля на високо-фруктозната диета за спонтанната проява на синдрома (за разлика от генетичните модели) и характеризира значението на хранителните фактори за развитието на затлъстяване и инсулинова резистентност, както и последващи метаболитни аномалии-дислипидемии, оксидативен стрес, нискостепенно възпаление, мастна дегенерация на черния дроб и апоптоза. От друга страна, резултатите подсказват установената от други автори роля на храненето за епигенетичните промени включени в регулацията на чернодробният глюкозен и липиден метаболизъм, някои от които са замесени в развитието и прогресирането на НМЧБ. Това прави експерименталният модел с ВФД иновативен по отношение на епигенетичните механизми и предлага нови перспективи за изследване на патогенезата на чернодробните увреждания, откриване на диагностични биомаркери и терапевтични стратегии за НМЧБ. Нашите данни представят убедителни доказателства, че при фруктозо-индуциран метаболитен синдром оксидативният стрес и нискостепенното системно възпаление са във функционална връзка с активираните апоптотични процеси (повишени съотношение на Bax/Bcl2 и CK18 протеин) в стеатозния черния дроб, което предполага, че апоптозата е доминиращ механизъм на клетъчна смърт при неалкохолен мастен черен дроб. Това налага и необходимостта от разработване и търсене на биомаркери за неинвазивно изсладване на активността на апоптозата и мониторирането й още в най-ранни етапи на чернодробна увреда. От друга страна нашите резултати показват, че затлъстяването и дисфункцията на висцералната мастна тъкан са основен патологичен фактор за интрахепатално отлагане на липиди и оксидативен стрес. Увеличената висцерална мастна тъкан е основен източник на повишена продукция на TNFа и експорт на СМК към черния дроб, които стимулирайки чернодробната инсулинова резистентност, de novo липогенеза и изчерпване на антиоксидантния капацитет на хепатоцитите предизвикват тъканни увреждания. В нашето проучване за първи път се установи въздействието на S-AMе и Алопуринол върху цитозащитата на хепатоцитите в условията на фруктозо-индуцираните метаболитни разстройства. Резултатите показват селективно действие на S-AMе и Алопуринол върху оксидативния стрес и производството на липиди, което протектира чернодробните клетки срещу клетъчна смърт и последващи увреждания. За разлика от други известни антиоксиданти, нашите данни показват, че S-AMе проявява антиоксидантно, антистеатозно и антиапоптотично действие. Благоприятното вляние върху липидния метаболизъм в черния дроб е значимо по-изразено от това на Алопуринола. Все повече доказателства сочат, че дисрегулацията на енергийния метаболизъм при НМЧБ е свързана и с епигенетични механизми на увреда, зависещи от адекватната биосинтеза на S-AMе, която е потисната при чернодробни увреждания. Следователно, екзогенния внос на S-AMе вероятно проявява хепатопротективно действие и чрез епигенетични промени в регулацията на чернодробния липиден метаболизъм. Тези данни представляват съществен интерес за нас и са предмет на нашите бъдещи проучвания. Резултатите от настоящото проучване показват, че защитният ефект на Алопуринола срещу продукцията на пикочна киселина и ксантиноксидаза-зависимото производство на АФК го прави конкурентен по отношение на антиоксидантната активност на S-AMе (а вероятно и спрямо други антиоксиданти). В групата на лечение с Алопуринол са установени по-ниски нива на МДА и по-високи нива на GSH спрямо групата приемаща S-AMе. Това предполага, че продуцирането на АФК от ксантиноксидазата е от съществено значение за фруктозо-индуцирания оксидативен стрес и нивата на пикочната киселина са значимо свързани с неалкохолния мастен чрен дроб. На базата на представените резултати може да се направи заключение, че апоптозата е съществен фактор в развитието и прогресирането на неалкохолния мастен черен дроб при ВФД, а оксидативния стрес и системното възпаление се очертават като основни звена в патофизиологичните механизми на клетъчни увреждания и смърт. Доказаният антиоксидантен, антилипидемичен, антистеатозен и хепатопртективен ефект на S-AMе и Алопуринол, разкрива нови възможности за терапевтично повлияване на свързаните със затлъстяването и инсулинова резистентност метаболитни нарушения. ИЗВОДИ 1. Високо-фруктозната диета приложена на плъхове предизвиква метаболитни нарушения, които отговаря на основните критерии за диагностика на МС при хора. 2. Промените в чернодробното съдържание на СМК (повишено съотношение на наситени/ненаситени СМК) са важен показател за адипоцитна дисфункция, инсулинова резистентност, повишена липидогенеза и оксидативен стрес при ВФД. 3. Апоптозата е доминиращ механизъм на клетъчна смърт (повишено съотношение на Bax/Bcl2 и CK18 протеини) при системно нискостепенно възпаление, оксидативни увреждания и мастна дегенерация на черния дроб индуцирани от ВФД. 4. Установена е функционална връзка между оксидативният стрес, нискостепенното системно възпаление и активираните апоптотични процеси в стеатозния черния дроб. 5. Прилагането на S-AMе и Алопуринол предотвратява фруктозо-индуцираните метаболитни нарушения при плъхове, потиска системният възпалителен отговор, ограничава оксидативните процеси и мастна дегенерация в черния дроб. 6. Приложението на S-AMе и Алопуринол при ВФД проявява селективен ефект: влиянието на S-AMе върху липидният метаболизъм е значимо по-изразено от Алопуринола, докато ефектите на Алопуринола върху оксидативния стрес са значимо по-изразени от тези на S-AMе. 7. Приложението на S-AMе и Алопуринол инхибира активираните апоптотични процеси и по този начин протектира оцеляването на хепатоцитите в условията на фруктозо-индуцираните оксидативни и метаболитни тъканни увреждания. 8.Съотвествието на серумните нива на апоптотичния СК-18 протеин с хистологичните и биохимични промени в черния дроб на експерименталните животни го определят като подходящ биомаркер за неинвазивна оценка на степента на чернодробните увреждания, тяхната прогресия и ефекта от прилагането на терапии при НМЧБ в експериментални и клинични условия.

Grantor dc:publisher

Medical University of Varna

Year dc:date

2019

Authors dc:creator

• Братоева, Камелия
• Bratoeva, Kameliya

• liver
• chronic
• Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD)
• nonalcoholic steatohepatitis (NASH)
• obesity
• diabetes
• hepatic apoptosis
• Физиология и патофизиология / Physiology and Pathophysiology

Repository record dc:identifier

http://repository.mu-varna.bg/handle/nls/183

OAI identifier oai:identifier

oai:repository.mu-varna.bg:nls/183