Comparative genetic analysis of GIGANTEA, a gene involved in the control of circadian rhythm in Solanaceae
[SPA] Las Solanáceas son una familia de plantas que van desde hierbas anuales hasta arbustos y árboles perennes. Incluyen muchas especies ornamentales apreciadas en todo el mundo, como el género Petunia, Browallia y Lycianthes, así como géneros de considerable impacto económico en el mercado mundial. Entre estos se encuentran la patata (S. tuberosum) tomate, (S .lycopersicum) y berenjena (S. melongena), tabaco (Nicotiana tabaccum) o pimiento (C. annuum) que incluye las variedades chili y pimiento dulce, dos de las más comercializadas en el mundo. El objetivo de esta tesis fue llevar a cabo un análisis genético comparativo del gen GIGANTEA (GI), para profundizar en el conocimiento de su expresión y regulación génica, así como el papel que desempeña en el control del desarrollo y ritmo circadiano en las Solanáceas. Para lograr los objetivos que nos propusimos analizamos en el sistema modelo Petunia x hybrida los dos parálogos préviamente identificados PhGI1 y PhGI2, a través de dos técnicas distintas: primero creando líneas de perdida de función, por cada uno de los dos parálogos, mediante técnica de ARN de interferencia y posteriormente mutantes knock-out mediante la técnica CRISPR/Cas9, para confirmar los resultados obtenidos. Se realizaron análisis de fenotipado de los caracteres vegetativos y reproductivos, genotipado y análisis de los componentes volátiles utilizando el método SPME desde el espacio de cabeza, seguido de GC/MS. Dentro de los estudios realizados hemos podido observar cómo los parálogos comparten funciones comunes. Ambos tienen efectos menores en el ritmo y la expresión de los genes del reloj. Esto es debido a que la función de GI ocurre a través de las interacciones proteína-proteína. PhGI1 y PhGI2 actúan como reguladores negativos del crecimiento vegetativo, controlando el tamaño y el contenido relativo de clorofila de las hojas, así como la longitud de entrenudos. Con respecto a los caracteres generativos, hemos identificado una nueva función aún no descrita hasta ahora. Líneas silenciadas para cada uno de los paralogos, presentaron flores abortadas caracterizadas por la senescencia temprana de los tejidos. Además, el número total y el tamaño de las flores fue menor en comparación con el fenotipo silvestre. Al mismo tiempo se observó como la cantidad y el perfil de los compuestos volátiles emitidos resultó afectado en las líneas silenciadas. La cantidad total de aromas emitidos durante 24 horas resultó inferior en comparación con el fenotipo silvestre y el perfil de aromas emitidos durante el día resultó alterado. Los resultados de está Tesis confirman que PhGI1 y PhGI2 están involucrados en el desarrollo floral. Observamos también diferentes fenotipos entre las líneas silenciadas para cada uno de los parálogos, particularmente en el control del tiempo de floración. Aunque el silenciamiento de PhGI1 no mostró ninguna diferencia en comparación con el fenotipo silvestre, plantas silenciadas en PhGI2 mostraron un retraso de entre dos/tres semanas más tarde en la floración, confirmándose como gen cuya pérdida de función provoca floración tardía, ya descrito en Arabidopsis thaliana. Estos datos confirmaron la hipótesis previa de que algunos genes duplicados podrían haber sufrido subfuncionalización o neofuncionalización. [ENG] Solanaceae are a family of plants ranging from annual grasses to evergreen shrubs and trees. They include many ornamental species appreciated around the world, such as the genus Petunia, Browallia and Lycianthes, as well as genera of considerable economic impact on the world trade such as potato (S. tuberosum), tomato (S .lycopersicum), eggplant (S. melongena), tobacco (Nicotiana tabaccum) and pepper (Capsicum annuum) that includes the chili pepper and bell pepper varieties, two of the most commercialized in the world. The objective of this thesis was to carry out a comparative genetic analysis of the GIGANTEA (GI) gene, to deepen the knowledge of its expression and gene regulation, as well as the role it plays in the control plant development and circadian rhythm in Solanaceae. In order to achieve the objectives that we set, we analyzed in the model system Petunia x hybrida the two paralogs previously identified PhGI1 and PhGI2, through two different techniques: first creating loss of function lines for each of the two paralogs, using the interference- RNA technique and subsequently knock-out mutants using the CRISPR/Cas9 technique to confirm the results obtained. Phenotypic analysis of vegetative and reproductive traits, genotyping and volatile components analysis were performed using the SPME method from the headspace, followed by GC/MS. Among the studies carried out we have been able to observe how the paralogs share common functions. Both have minor effects on the timing and expression of clock genes, this could be because GI molecular function occurs through protein-protein interactions. PhGI1 and PhGI2 act as negative regulators of vegetative growth, controlling the size and relative content of chlorophyll in the leaves, as well as the internode distance. Regarding generative characters, we have identified a new function non described so far. Both, PhGI1 and PhGI2, silenced plants presented aborted flowers characterized by early tissue senescence. Furthermore, the size and total number of the flowers were reduced compared to the wild type phenotypes. At the same time, it was observed how the amount and the profile of the volatile compounds emitted were affected in the silenced lines. The total amount of aromas emitted during 24 hours was lower compared to wild type phenotypes and the profile of aromas emitted during the day was altered. Our results confirm that PhGI1 and PhGI2 are involved in flower development. We also observed different behaviors between the silencing of each paralog, particularly in the control of the flowering time. Although PhGI1-silenced plants did not show difference compared to wild type phenotypes, PhGI2-silenced plants flowered two to three weeks later, confirming itself as a late-flowering mutant, as already described in Arabidopsis thaliana. These data confirmed the previously hypothesized idea that some duplicate may undergo subfunctionalization or neofunctionalization.
Biología molecular, Biología molecular de plantas, Genética vegetal, Solanáceas
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