Inhibición de la producción de etileno, y otros sistemas enzimáticos degradativos de la calidad postcosecha de productos hortofrutícolas, mediante sistemas de envasado con aceites esenciales
[SPA] Esta tesis doctoral se presenta bajo la modalidad de compendio de publicaciones. España es un país muy importante dentro de la Unión Europea en cuanto a la producción y exportación de frutas y hortalizas, siendo la Región de Murcia una de las Comunidades Autónomas que más destacan en este sector de la economía. No obstante, existe una gran competencia con los distintos países, especialmente con los países del sureste europeo ya que tienen precios más bajos, aunque con una calidad inferior a la de nuestros productos frescos. Por lo tanto, es necesario innovar en las tecnologías postcosecha, por ejemplo, sistemas de envasado innovadores, para que se conserven mejor los productos hortofrutícolas españoles durante la distribución y lleguen al consumidor con una calidad superior a la de los demás países, incluyendo mejores características microbiológicas, organolépticas y de seguridad alimentaria. En ese sentido, el grupo de investigación en el cual se ha realizado la presente Tesis Doctoral ha trabajado en los últimos años en el desarrollo y optimización de sistemas de envasado activo sostenibles (cartón/papel reciclado) con aceites esenciales encapsulados (en complejos de inclusión con ciclodextrinas) para preservar la calidad postcosecha de frutas y hortalizas. En dichas investigaciones previas se ha observado el efecto beneficioso de dichos sistemas de envasado sobre la calidad del producto; aunque para seguir avanzando en su optimización hacia envases aún más eficientes es necesario conocer en detalle el efecto inhibidor de dichos aceites esenciales liberados de estos envases activos sobre los sistemas enzimáticos clave que regulan el metabolismo postcosecha de maduración y senescencia (producción de etileno, procesos degradativos de calidad como pérdida de firmeza, pardeamiento, etc.). Por último, siempre es necesario realizar una validación de dichos sistemas de envasado activo (fabricados entonces ya a nivel industrial) sobre diferentes grupos de frutas y hortalizas simulando condiciones reales de conservación refrigerada y comercialización bajo diferentes escenarios de temperaturas y humedades relativas, tanto óptimas como desaconsejadas pero habituales en la cadena de distribución. En concreto, el etileno tiene un papel crucial en la maduración de las frutas y hortalizas, por lo que la presencia de etileno endógeno en el ambiente puede acelerar el proceso de avance hacia la senescencia, la pérdida de calidad y la disminución de la vida útil de estos productos. En concreto, algunos productos hortofrutícolas como el brócoli tienen una baja producción de etileno, mientras que para otros como el tomate sucede el caso contrario. Asimismo, el mayor crecimiento microbiano en estos productos induce mayores tasas de respiración y producción de etileno, lo que contribuye aún más a la reducción de su vida útil. Además de las enzimas clave en la ruta biosintética del etileno, encontramos otras enzimas degradativas clave que afectan a diferentes atributos de calidad postcosecha del producto como son la firmeza (pectinmetilesterasa, poligalacturonasa, etc.), pardeamiento (polifenoloxidasa, peroxidasa, etc.), calidad nutricional (por ejemplo, reducción de vitamina C por la ascorbato peroxidasa, etc.), etc. Sin embargo, otros sistemas enzimáticos (catalasa, superóxido dismutasa, etc.) pueden incrementarse también mediante diferentes compuestos, como los que componen los aceites esenciales, al ser interpretados por las células vegetales como estreses abióticos. Por ello, son necesarios tratamientos postcosecha efectivos y sostenibles para controlar dichos procesos degradativos de la calidad postcosecha de los productos hortofrutícolas. Entre ellos se han usado convencionalmente la conservación refrigerada, inhibidores de la biosíntesis del etileno, absorbedores de etileno, etc. Los aceites esenciales (aparte de sus propiedades antimicrobianas ampliamente conocidas) han mostrado un efecto inhibidor de la producción de etileno postcosecha en frutas y hortalizas, aunque un estudio profundo sobre su acción sobre la actividad de las enzimas clave de dicha ruta biosintética no se ha realizado aún. Además, también se ha reportado el efecto beneficioso de los aceites esenciales para preservar diferentes atributos de calidad postcosecha de frutas y hortalizas, los cuales están regulados por enzimas clave degradativas de esta calidad y cuyos mecanismos de inhibición de dichas actividades enzimáticas tampoco han sido caracterizados en profundidad. Aparte del alto potencial del uso de los aceites esenciales como tratamientos postcosecha sostenibles, su uso no se ha terminado de implantar por dichas empresas hortofrutícolas debido a que las dosis reales (in vivo) necesarias son muy altas (en comparación a las dosis efectivas determinadas en laboratorio (in vitro)), lo que conllevaría a un rechazo del consumidor por la percepción de dichos olores/sabores extraños típicos de los aceites esenciales. Por ello, la encapsulación de los aceites esenciales, y su incorporación en envases activos permite obtener dosis efectivas en fase gaseosa alrededor del producto con mayor o menor ratio de liberación, es decir, mediante una liberación controlada. Un método de encapsulación eficiente, sencillo y económicamente viable es la formación de complejos de inclusión utilizando ciclodextrinas nativas, en concreto β-ciclodextrina. La posterior incorporación de dichos complejos de inclusión aceite esencial-ciclodextrina sobre cartón corrugado mediante lacas (de base acuosa) ecológicas permite obtener así un envase activo sostenible, frente a los envases plásticos convencionales cuyo uso está siendo limitado cada vez más por las regulaciones europeas. Dichos complejos de inclusión permiten una liberación lenta y controlada, que puede verse incrementada bajo situaciones como las mayores humedades relativas en las cámaras de conservación y condiciones no óptimas como son las mayores temperaturas durante la distribución de estos productos en los supermercados. Por ello, el principal objetivo de esta Tesis Doctoral fue estudiar en detalle el efecto de aceites esenciales encapsulados que se liberaban de los envases activos, fabricados para tal efecto, sobre enzimas clave de la ruta biosintética del etileno, así como las relacionadas con otros procesos degradativos de atributos de calidad postcosecha de frutas y hortalizas frescas como son: firmeza, color, calidad fisicoquímica (sólidos solubles y acidez), calidad microbiológica, etc. La selección de los aceites esenciales estudiados en cada artículo se realizó en función de su alta capacidad para inhibir la biosíntesis de etileno, así como para mantener la calidad postcosecha del producto durante la conservación, basándose en estudios preliminares entre más de 50 tipos de aceites esenciales y sus principales componentes. En el primer artículo se estudiaron las cinéticas de liberación de aceites esenciales (se usó el carvacrol como componente modelo de aceites esenciales) contenidos en envases activos bajo diferentes condiciones de temperatura y humedad relativa, así como si el envase se encontraba cerrado o abierto. Se observó que el carvacrol se liberó de forma más rápida desde los envases activos a temperaturas y humedades relativas más altas, produciéndose así un aumento de 1,3-1,7 veces de la tasa de liberación cuando la humedad relativa amentó del 60 al 90-95 %. Además, la máxima tasa de liberación (0,14/2,0 × 10-2 1/dían) fue alcanzada en el escenario de un envase activo abierto a 8/15 °C y 95 % de humedad relativa. En los artículos segundo y tercero se estudió el efecto de los aceites esenciales liberados de envases activos (con diferentes tipos de aceites esenciales y dosis) sobre la producción de etileno en frutas (arándano y mora; artículo segundo) y hortalizas (brócoli y tomate; artículo tercero) frescas, así como de las actividades de las enzimas clave y compuestos intermedios de la ruta biosintética del etileno. Se observó una reducción entre un 20 y 60 % de las actividades de las enzimas clave de la producción de etileno en tomate conservado en envases activos con timol o aceite esencial de romero. En el caso del brócoli, un envase activo con aceite esencial de pomelo alcanzó ratios de inhibición del 30-45 %. En cuanto a las dosis óptimas, para el tomate, un envase activo con una dosis de 1000 mg m-2 fue la que mostró mayor inhibición de la producción de etileno, mientras que una dosis de 500 mg m-2 con aceite esencial de pomelo alcanzó los mismos efectos en brócoli. En el cuarto artículo se validó el efecto de envases activos con carvacrol y eugenol sobre la calidad postcosecha de limones conservados en refrigeración, con períodos de comercialización complementarios a temperatura ambiente. Los envases activos consiguieron reducir el crecimiento microbiano en aproximadamente 1,6-2 unidades logarítmicas comparado con envases no activos, así como una menor incidencia de podredumbres en los períodos de comercialización. Además, dichos envases activos preservaron mejor la calidad nutricional (vitamina C) y bioactiva (compuestos fenólicos) de los limones, con incrementos aproximadamente 2 veces superiores a los de los envases control, gracias a la activación de los sistemas enzimáticos antioxidantes (por ejemplo, catalasa, superóxido dismutasa, etc.). Finalmente, la calidad fisicoquímica de los limones no se vio afectada por dichos envases activos. En el quinto artículo se validó el efecto de envases activos con aceites esenciales de orégano, canela y carvacrol sobre la calidad postcosecha de melocotones paraguayos conservados en refrigeración, con períodos de comercialización complementarios a temperatura ambiente. Se observó que los aceites esenciales liberados de los envases activos redujeron la producción de etileno del producto en un 40-50 y 70 % durante los períodos de refrigeración y comercialización, respectivamente, lo que se reflejó a su vez en una inhibición de las actividades de las enzimas clave de la ruta biosintética del etileno. Los envases activos también preservaron mejor la calidad fisicoquímica de los paraguayos gracias a la inhibición de las actividades de las correspondientes enzimas degradativas de las estructuras celulares y responsables del pardeamiento (poligalacturonasa y polifenoloxidasa). Además, los aceites esenciales liberados de los envases activos aumentaron el contenido de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante en un 30 y 70 %, respectivamente. Finalmente, en el sexto artículo se validó también un sistema de envasado activo con aceites esenciales (aceites esenciales de bergamota, pomelo y eugenol) sobre la calidad postcosecha de champiñón laminado, así como sobre los sistemas enzimáticos degradativos de dicha calidad durante su conservación refrigerada. La actividad de la polifenoloxidasa, así como el pardeamiento asociado, fueron controlados mediante una concentración de aceites esenciales de 100 μL L−1 alrededor del producto. Además, los aceites esenciales mediante este sistema de envasado consiguieron controlar el crecimiento microbiano (en concreto, Pseudomonas spp.) con recuentos aproximadamente 1,7 unidades log menores que el control. En conclusión, esta Tesis Doctoral presenta una investigación sobre envases activos sostenibles (cartón/papel) con aceites esenciales encapsulados para preservar la calidad postcosecha de frutas y hortalizas frescas, y así extender su vida útil. En particular, se caracterizó el potencial inexplotado de los aceites esenciales liberados de dichos envases activos para controlar la producción de etileno mediante la inhibición de las actividades de enzimas clave, junto con sus efectos sobre otras enzimas clave que limitan los atributos de calidad postcosecha de estos productos como son la firmeza, el color, la calidad nutricional/bioactiva, entre otros.[ENG] This doctoral dissertation has been presented in the form of thesis by publication. Spain is a very important country within the European Union in terms of the production and export of fruit and vegetables, being the Region of Murcia one of the Autonomous Communities that stands out in this sector of the economy. However, there is great competition with different countries, especially with the countries of Southeast Europe as they have lower prices, although with a lower quality than our fresh produce. Therefore, it is necessary to innovate in postharvest technologies, for example, innovative packaging systems, so that Spanish plant products are better preserved during distribution and reach the consumer with a higher quality than that of other countries, including better microbiological, organoleptic and food safety characteristics. In this sense, the research group in which this PhD Thesis has been carried out has worked in recent years on the development and optimization of sustainable active packaging systems (recycled cardboard/paper) with encapsulated essential oils (in inclusion complexes with cyclodextrins) to preserve the postharvest quality of fruit and vegetables. Previous research has shown the beneficial effect of such packaging systems on product quality; however, in order to further advance in their optimization towards even more efficient packaging, it is necessary to know in detail the inhibitory effect of such essential oils released from these active packages on the key enzymatic systems that regulate the postharvest metabolism of ripening and senescence (ethylene production, quality-degrading processes such as loss of firmness, browning, etc.). Finally, it is always necessary to carry out a validation of these active packaging systems (manufactured also at the industrial level) on different groups of fruit and vegetables by simulating real conditions of refrigerated storage and marketing under different scenarios of temperatures and relative humidity, both optimal and inadvisable but common in the distribution chain. Specifically, ethylene plays a crucial role in the ripening of fruit and vegetables, so the presence of endogenous ethylene in the environment can accelerate the process of moving towards senescence, loss of quality and shortened shelf life of these products. In particular, some fruit and vegetables such as broccoli have low ethylene production, while the opposite behaviour is shown by others like tomatoes. Also, increased microbial growth in these products induces higher rates of respiration and ethylene production, which further contributes to the reduction of their shelf life. In addition to the key enzymes in the ethylene biosynthetic pathway, we find other key degradative enzymes that affect different postharvest quality attributes of the product such as firmness (pectin methylesterase and polygalacturonase), browning (polyphenol oxidase and peroxidase), nutritional quality (e.g., vitamin C reduction by ascorbate peroxidase). However, other enzyme systems (catalase and superoxide dismutase) can also be increased by different compounds, such as essential oils, which can be interpreted by plant cells as abiotic stresses. Therefore, effective and sustainable postharvest treatments are necessary to control such degradative processes of postharvest quality of fruit and vegetables. Among them, refrigerated storage, ethylene biosynthesis inhibitors, ethylene absorbers, etc., have been conventionally used. Essential oils (apart from their widely known antimicrobial properties) have shown an inhibitory effect on postharvest ethylene production in fruit and vegetables, although an indepth study on their action on the activity of key enzymes of this biosynthetic pathway has not Spain is a very important country within the European Union in terms of the production and export of fruit and vegetables, being the Region of Murcia one of the Autonomous Communities that stands out in this sector of the economy. However, there is great competition with different countries, especially with the countries of Southeast Europe as they have lower prices, although with a lower quality than our fresh produce. Therefore, it is necessary to innovate in postharvest technologies, for example, innovative packaging systems, so that Spanish plant products are better preserved during distribution and reach the consumer with a higher quality than that of other countries, including better microbiological, organoleptic and food safety characteristics. In this sense, the research group in which this PhD Thesis has been carried out has worked in recent years on the development and optimization of sustainable active packaging systems (recycled cardboard/paper) with encapsulated essential oils (in inclusion complexes with cyclodextrins) to preserve the postharvest quality of fruit and vegetables. Previous research has shown the beneficial effect of such packaging systems on product quality; however, in order to further advance in their optimization towards even more efficient packaging, it is necessary to know in detail the inhibitory effect of such essential oils released from these active packages on the key enzymatic systems that regulate the postharvest metabolism of ripening and senescence (ethylene production, quality-degrading processes such as loss of firmness, browning, etc.). Finally, it is always necessary to carry out a validation of these active packaging systems (manufactured also at the industrial level) on different groups of fruit and vegetables by simulating real conditions of refrigerated storage and marketing under different scenarios of temperatures and relative humidity, both optimal and inadvisable but common in the distribution chain. Specifically, ethylene plays a crucial role in the ripening of fruit and vegetables, so the presence of endogenous ethylene in the environment can accelerate the process of moving towards senescence, loss of quality and shortened shelf life of these products. In particular, some fruit and vegetables such as broccoli have low ethylene production, while the opposite behaviour is shown by others like tomatoes. Also, increased microbial growth in these products induces higher rates of respiration and ethylene production, which further contributes to the reduction of their shelf life. In addition to the key enzymes in the ethylene biosynthetic pathway, we find other key degradative enzymes that affect different postharvest quality attributes of the product such as firmness (pectin methylesterase and polygalacturonase), browning (polyphenol oxidase and peroxidase), nutritional quality (e.g., vitamin C reduction by ascorbate peroxidase). However, other enzyme systems (catalase and superoxide dismutase) can also be increased by different compounds, such as essential oils, which can be interpreted by plant cells as abiotic stresses. Therefore, effective and sustainable postharvest treatments are necessary to control such degradative processes of postharvest quality of fruit and vegetables. Among them, refrigerated storage, ethylene biosynthesis inhibitors, ethylene absorbers, etc., have been conventionally used. Essential oils (apart from their widely known antimicrobial properties) have shown an inhibitory effect on postharvest ethylene production in fruit and vegetables, although an in-depth study on their action on the activity of key enzymes of this biosynthetic pathway has not been carried out. In addition, the beneficial effect of essential oils in preserving different post-harvest quality attributes of fruit and vegetables, which are regulated by key degradative enzymes of this quality and whose mechanisms of inhibition of these enzymatic activities have not been characterized in depth, has also been reported. Apart from the high potential of the use of essential oils as sustainable postharvest treatments, their use has not been fully implemented by these fruit and vegetable companies because the actual (in vivo) doses required are very high (compared to the effective doses determined in the laboratory (in vitro)), which would lead to consumer rejection due to the perception of strange odours/flavours typical of essential oils. For this reason, the encapsulation of essential oils and their incorporation in active packaging allows us to obtain effective doses in the gas phase around the product with a higher or lower release ratio, i.e. by means of a controlled release. An efficient, simple and economically viable encapsulation method is the formation of inclusion complexes using native cyclodextrins, specifically β-cyclodextrin. The subsequent incorporation of such essential oil-cyclodextrin inclusion complexes on corrugated cardboard using environmentally friendly (water-based) lacquers thus makes it possible to obtain sustainable active packaging, as opposed to conventional plastic packaging whose use is becoming increasingly limited by European regulations. Such inclusion complexes allow a slow and controlled release, which can be increased under situations such as higher relative humidities in storage chambers and non-optimal conditions such as higher temperatures during the distribution of these products in supermarkets. Therefore, the main objective of this Doctoral Thesis was to study in detail the effect of encapsulated essential oils released from the active packaging, manufactured for this purpose, on key enzymes of the ethylene biosynthetic pathway, as well as those related to other degradative processes of postharvest quality attributes of fresh fruit and vegetables such as firmness, colour, physicochemical quality (soluble solids and acidity), microbiological quality, etc. The selection of the essential oils studied in each article was made according to their high capacity to inhibit ethylene biosynthesis, as well as to keep the product postharvest quality during conservation, based on preliminary studies among more than 50 types of essential oils and their main components. In the first article, the release kinetics of essential oils (carvacrol was used as a model component of essential oils) contained in active packaging were studied under different conditions of temperature and relative humidity, as well as whether the container was closed or open. It was observed that carvacrol was released more rapidly from the active packaging at higher temperatures and relative humidities, resulting in a 1.3-1.7-fold increase in the release rate when the relative humidity increased from 60 to 90-95 %. Furthermore, the maximum release rate (0.14/2.0 × 10-2 1/dayn) was achieved in the scenario of an open active package at 8/15 °C and 95 % relative humidity. In the second and third articles, the effect of essential oils released from active packaging (with different types of essential oils and doses) on ethylene production in fresh fruit (blueberry and blackberry; second article) and vegetables (broccoli and tomato; third article), as well as on the activities of key enzymes and intermediate compounds of the ethylene biosynthetic pathway, were studied. A 20-60 % reduction in the activities of key enzymes of ethylene production was observed in tomatoes with active packaging including thymol or rosemary essential oil. In the case of broccoli, an active package with grapefruit essential oil achieved inhibition ratios of 30-45 %. As for optimal doses, for tomato, an active package with a dose of 1000 mg m-2 showed the highest inhibition of ethylene production, while a dose of 500 mg m-2 with grapefruit essential oil achieved the same effects in broccoli. The fourth article validated the effect of carvacrol and eugenol active packaging on the postharvest quality of lemons during cold storage, with complementary commercialization periods at ambient temperature. The active packaging achieved a reduction in microbial growth of approximately 1.6-2 log units compared to non-active packages, as well as a lower decay incidence during the commercialization periods. In addition, such active packaging better preserved the nutritional (vitamin C) and bioactive (phenolic compounds) quality of lemons, with approximately 2-fold increases compared to control packages, thanks to the activation of antioxidant enzyme systems (e.g., catalase, superoxide dismutase, etc.). Finally, the physicochemical quality of the lemons was not affected by the active packaging. The fifth article validated the effect of active packaging with essential oils of oregano, cinnamon and carvacrol on the postharvest quality of flat peaches preserved under refrigeration, with complementary marketing periods at room temperature. It was observed that the essential oils released from the active packages reduced the ethylene production of the product by 40-50 and 70 % during the cold storage and commercialization periods, respectively, which in turn was reflected in an inhibition of the activities of key enzymes of the ethylene biosynthetic pathway. The active packages also better preserved the physicochemical quality of the flat peaches by inhibiting the activities of the corresponding cell structure-degrading and browning enzymes (polygalacturonase and polyphenoloxidase). In addition, the essential oils released from the active packaging increased the content of phenolic compounds and antioxidant capacity by 30 and 70 %, respectively. Finally, the sixth article also validated an active packaging system with essential oils (essential oils of bergamot, grapefruit and eugenol) on the postharvest quality of fresh-cut mushrooms, as well as on the enzymatic systems degrading this quality during cold storage. Polyphenol oxidase activity, as well as the associated browning, was controlled using an essential oil concentration of 100 μL L-1 around the product. In addition, essential oils of this packaging system were able to control microbial growth (specifically, Pseudomonas spp.) with approximately 1.7 lower log units compared to control packaging. In conclusion, this PhD Thesis presents an investigation on sustainable active packaging (recycled cardboard/paper) with encapsulated essential oils to preserve the postharvest quality of fresh fruit and vegetables, thus extending their shelf life. In particular, the high (and unexplored) potential of essential oils released from such active packaging to control ethylene production by inhibiting the activities of key enzymes was characterized, along with their effects on other key enzymes that limit the postharvest quality attributes of these products, such as firmness, colour, nutritional/bioactive quality, among others.
Tecnologías postcosecha, Complejo de inclusión, Calidad, Brassica oleracea var. italica
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