Diseño y estudios analíticos de microemulsiones portadoras de fármacos y biocidas
El desarrollo de nuevos productos farmacéuticos y de cuidado personal que proporcionen múltiples acciones terapéuticas, más selectivas, duraderas o con menos efectos adversos para el organismo, es un desafío permanente en el campo de la investigación farmacéutica y cosmética. Sin embargo, existen problemas relacionados con la biodisponibilidad y estabilidad de distintas moléculas activas atribuibles principalmente al sistema portador o forma farmacéutica en la cual es vehiculizada, lo que promueve el diseño de nuevos sistemas portadores capaces de mejorar la efectividad terapéutica. En particular, es importante potenciar el desarrollo de formulaciones innovadoras, de bajo costo y mediante procedimientos sostenibles, que puedan llegar a distintos sectores de la sociedad y contribuyan a resolver problemáticas de salud pública como los efectos de la exposición solar excesiva y las infecciones ocasionadas por ciertos patógenos oportunistas, así como problemáticas que comprometen la producción y salud animal como ciertas enfermedades virales que afectan al ganado bovino. Por otro lado, el desarrollo de nuevas formulaciones involucra la implementación de procedimientos analíticos para la evaluación de su eficacia y estabilidad. En este contexto, es necesario el desarrollo de nuevas metodologías analíticas sostenibles que reemplacen parcial o totalmente los métodos actuales de análisis, los cuales suelen involucrar el uso de técnicas costosas y poco amigables con el ambiente. Las microemulsiones son sistemas dispersos y organizados constituidos por una fase oleosa, una fase acuosa y una mezcla de surfactante:co-surfactante, las cuales son transparentes, ópticamente isotrópicas y termodinámicamente estables. La existencia de microdominios de diferente polaridad posibilita solubilizar compuestos tanto hidrofílicos como lipofílicos, incluso si resulta de interés en simultáneo en la misma formulación. Las microemulsiones se han utilizado para cargar fármacos y biocidas con el objetivo de mejorar su biodisponibilidad y estabilidad. Estos sistemas presentan la capacidad de proteger compuestos lábiles y permitir la liberación del activo cargado de forma sostenida y controlada. Además, la obtención de estos sistemas es simple, rápida y requiere de procedimientos de baja energía lo que contribuye a la sustentabilidad. Por otro lado, la vía de administración de un fármaco supone un factor determinante en las propiedades farmacocinéticas del mismo, condicionando en última instancia su eficacia y efecto biológico. El desarrollo de nuevos sistemas portadores tiene como objetivo mejorar las propiedades farmacocinéticas del fármaco de manera que disminuya al máximo los efectos adversos dependientes de la vía de administración y su distribución posterior en el organismo. En particular, la vía de administración tópica permite aplicar el fármaco en el lugar de acción de tal manera que el efecto es local, evitando la absorción sistémica del mismo. Esta vía se utiliza para el tratamiento local de afecciones de la piel evitando el primer paso hepático y las fluctuaciones de las concentraciones plasmáticas. Además, permite una absorción adecuada del fármaco, reduce la variabilidad interindividual en la absorción, prolonga la duración de la acción y mejora el cumplimiento terapéutico. Además, es la vía utilizada para la aplicación de diferentes productos de cuidado personal tales como protectores solares. En la primera parte del presente trabajo de Tesis, se diseñó una nueva formulación del tipo microemulsión aceite en agua (o/w) como portador del filtro químico solar benzofenona-3 (BZ3), a partir de materiales biocompatibles y de uso común en la producción de productos de uso cosmético como miristato de isopropilo (fase oleosa), Tween 80: etanol (surfactante:co-surfactante) y agua (fase acuosa). Mediante la construcción de diagramas de fases pseudoternarios se obtuvieron distintas microemulsiones las cuales se caracterizaron fisicoquímicamente. En base a estos resultados se seleccionó un sistema óptimo para la carga de BZ3 al 2,0% (p/p). La formulación obtenida (BZ3-ME) estuvo compuesta por 2,5% (p/p) de miristato de isopropilo, 42,0% (p/p) de una mezcla Tween 80: etanol (2:1) y 55,5% (p/p) de agua. La misma presentó una distribución de tamaño uniforme (PdI = 0,224 ± 0,017) y un tamaño de gota en el rango nanométrico (Z = 11,90 ± 0,93 nm). El pH obtenido (5,50 ± 0,03) resultó apropiado para la aplicación tópica y los resultados de índice de refracción (1,3350 ± 0,0002) y conductividad eléctrica (0,065 ± 0,010) mS corroboraron que se trató de un sistema isotrópico y de tipo aceite en agua (o/w), respectivamente. Entonces, se realizaron estudios analíticos de degradación térmica de BZ3 a 60ºC para evaluar el comportamiento del filtro cuando se encontraba cargado en la microemulsión (BZ3-ME) respecto a cuando se encontraba en un medio no-organizado (BZ3-NO). La detección se realizó mediante espectrometría de fluorescencia molecular lo que permitió monitorear en tiempo real dicho proceso y obtener los correspondientes perfiles de degradación térmica. El perfil de BZ3-NO presentó una disminución en la concentración de BZ3 a lo largo del tiempo de análisis, arrojando una constante cinética de termodegradación Kt de (0,069 ± 0,001) min- 1 mientras que el perfil de BZ3-ME se mantuvo sin cambios bajo las condiciones de estudio. Esto indicó que el sistema portador protegió de cierta manera al filtro químico solar de la degradación inducida por la temperatura, en las condiciones estudiadas. Por otra parte, se abordó un estudio de permeación in-vitro de BZ3-ME utilizando la tradicional celda de difusión de Franz, y mediante detección por espectrometría de absorción molecular UV-Vis. El proceso de permeación de BZ3 se registró durante 60 min utilizando una membrana sintética de acetato de celulosa. La concentración acumulada de BZ3 por unidad de área se relacionó linealmente con el tiempo de permeación, y a partir del perfil de permeación de BZ3 se calculó la correspondiente constante de permeación Kp la cual fue de (3,06 x 10-3 ± 4,0 x 10-7) cm h-1 sugiriendo que BZ3 presentó un perfil de permeación adecuado en el sistema portador propuesto y comparable con el filtro cargado en otros sistemas portadores reportados en la literatura. Finalmente, se determinó la eficacia de BZ3-ME mediante la determinación del factor de protección solar in-vitro (FPSin-vitro) el cual fue 2,0, un valor esperable dada la concentración de filtro químico utilizado y a que fue el único filtro cargado en la microemulsión. En un segundo trabajo, se utilizó la microemulsión previamente obtenida como sistema portador de ciprofloxacina (CIP), el cual es un antibiótico de amplio espectro utilizado para el tratamiento de infecciones causadas por el patógeno oportunista Staphylococcus aureus. En este caso, se logró cargar de manera exitosa la microemulsión con una concentración final de CIP de 0,3% (p/p) la cual estuvo dentro del rango terapéutico. La formulación (CIP-ME) se caracterizó fisicoquímicamente y los resultados mostraron que se trató de un sistema monodisperso (PdI = 0,259 ± 0,021) y con un tamaño de gota nanométrico (Z = 13,44 ± 0,24 nm), lo que en este caso fue corroborado a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Además, la formulación presentó un valor de pH de 5,32 ± 0,01 el cual resultó óptimo para uso tópico e intranasal y una osmolaridad de 341,9 mOsm L-1 la cual resultó adecuada para la instilación. Por otro lado, se estudió mediante espectrometría de fluorescencia molecular la distribución de CIP en la microemulsión (o/w), dada la moderada solubilidad del antibiótico en agua, concluyendo que éste se ubicó preferentemente en la interfase fase oleosa-fase acuosa, e interaccionando probablemente con el surfactante. A su vez, se abordó un estudio de permeación in-vitro para el cual se diseñó un sistema automático en línea, de fácil implementación, bajo costo y utilizando electrónica Arduino, el cual empleó la tradicional celda de difusión de Franz y permitió monitorear en tiempo real mediante espectroscopía de fluorescencia molecular el proceso de permeación de CIP a través de una membrana sintética que simuló la piel. A partir del análisis espectral se obtuvieron los perfiles de permeación de CIP en la microemulsión (CIP-ME) y en un medio no-organizado (CIP- NO) que permitieron calcular las correspondientes constantes de permeación (Kp). Los resultados obtenidos de la cinética de permeación de CIP en CIP-ME (Kp = 2,76 × 10−4 ± 9,00 × 10−6) respecto a CIP-NO (5,30 × 10−5 ± 5,0 × 10−7) mostraron que la difusión a través de la membrana de CIP en CIP-NO fue significativamente menor en contraste con CIP-ME. Por último, se realizaron estudios biológicos in-vitro e in-vivo de la actividad antimicrobiana utilizando un modelo murino de infección cutánea y otro de infección intranasal para comprobar la efectividad de la formulación propuesta, y de esta manera obtener la eficacia terapéutica en el sitio de la infección. Entonces, se evaluaron los efectos de CIP-ME sobre la piel de ratones infectados por S. aureus. Luego de 24 h de la infección se observó una reducción visible de las lesiones y del eritema en el área afectada cuando los ratones fueron tratados con CIP-ME respecto a los ratones del grupo control, que presentaron lesiones ulceradas y eritematosas con escaso exudado. Además, el número de bacterias viables recuperadas de la piel de los ratones tratados con CIP-ME fue significativamente menor que el de los grupos control, lo que demostró que el tratamiento con CIP-ME provocó una reducción significativa de la infección en piel por S. aureus en ratones. En el caso de los estudios de colonización intranasal, el número de bacterias viables recuperadas de la nariz de ratones tratados con la formulación propuesta resultó 1,2 × 103 UFC mL−1, un valor que fue significativamente menor que los correspondientes a la microemulsión sin carga, el cual fue 2,8 × 104 UFC mL−1, y que el grupo control, el cual presentó 4,7 × 104 UFC mL−1. Esto demostró que el tratamiento con CIP-ME provocó una reducción significativa de la colonización nasal de S. aureus en ratones. Finalmente, en la última parte de la Tesis se planteó el diseño y obtención de un nuevo sistema del tipo microemulsión (o/w) basada en activos naturales con capacidad antioxidante y antiviral frente a betacoronavirus bovino (BCoV) y alfaherpesvirus bovino 1 (BoHV-1) para uso tópico. Para ello, se utilizó como fase oleosa aceite esencial de albahaca (AEA), el cual presenta comprobadas propiedades antivirales, una mezcla de Cremophor EL: etanol (CR:ET) como surfactante:co-surfactante y agua como fase acuosa. Se realizaron diagramas de fases pseudoternarios y los sistemas seleccionados se caracterizaron fisicoquímicamente y fueron sometidos a estudios de estabilidad acelerada que involucraron un test de centrifugación y ciclos de frío-calor. Luego se seleccionó el sistema óptimo, el cual estuvo compuesto por 5,0% de AEA, 30,0% de CR:ET (2:1) y 65,0% de agua. El mismo se cargó posteriormente con el antioxidante natural quercetina (QE) a una concentración final de 100 mg L-1. La microemulsión cargada con quercetina (QE-ME) presentó un tamaño de gota nanométrico de (17,47 ± 0,33) nm y un PdI de 0,049 ± 0,027. El valor de pH obtenido 4,69 ± 0,10 resultó adecuado para uso tópico. Con respecto a los valores de índice de refracción (1,3378 ± 0,0013) y conductividad eléctrica (0,101 ± 0,010) mS cm-1, éstos corroboraron que QE-ME resultó ser un sistema isotrópico y de tipo (o/w), respectivamente. En este caso, el estudio de permeación se realizó mediante un nuevo método analítico miniaturizado denominado mini-Franz, que reemplazó a la tradicional celda de difusión de Franz por una celda estándar de cuarzo con un dispositivo portamembrana/portamuestra desarrollado con tecnología 3D, y un sistema de agitación magnética que se acopló directamente al portacelda de un espectrofotómetro UV-Vis. Esto permitió obtener los datos del proceso de permeación de QE-ME en tiempo real, reduciendo volumen de muestra y solución aceptora, y minimizando la generación de residuos. El valor de Kp obtenido (5,96 × 10−3 ± 5,0 × 10−7) cm h−1 resultó adecuado para su aplicación tópica. Además, se validó el nuevo método propuesto frente al método de difusión de Franz tradicional demostrando que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ambas metodologías. Por otro lado, se evaluó la eficacia antiviral de la formulación a través de diferentes ensayos in-vitro. Por un lado, se evaluó la citotoxicidad de la microemulsión sin carga (ME) y cargada con quercetina (QE-ME) en líneas celulares de adenocarcinoma rectal (HRT-18) y de riñón bovino (MDBK) para BCoV y BoHV-1, respectivamente. Luego, se realizó un ensayo de pre-tratamiento en el cual las monocapas celulares se expusieron a las microemulsiones y posteriormente fueron inoculadas con los virus en estudio. Por último, se evaluó la capacidad de las microemulsiones de adsorber los viriones de BCoV y BoHV-1 a través del ensayo de adsorción viral (binding). Con respecto al ensayo de pre- tratamiento, en ambos casos se observó una reducción significativa en los títulos virales en todos los grupos pre-tratados con microemulsiones, cargadas con quercetina como sin cargar, en comparación con el control positivo, es decir, monocapas celulares infectadas sin exposición previa a las microemulsiones. De la misma manera, el ensayo de binding para ambos virus demostró que las formulaciones evaluadas (ME y QE-ME) lograron reducir significativamente los títulos virales en comparación con el control no tratado con microemulsiones. Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los títulos virales de BCoV y BoHV-1 obtenidos tras el tratamiento con las distintas microemulsiones, es decir, ME y QE-ME. Estos resultados mostraron que, bajo las condiciones ensayadas, la presencia de QE no mejoró la actividad antiviral de las microemulsiones en la concentración estudiada. Por último, se determinó la capacidad antioxidante de ME y QE-ME mediante el método DPPH (2,2-difenil-1- picrilhidrazilo). La microemulsión sin carga no presentó una tendencia definida en su actividad antioxidante con el aumento de la concentración, alcanzando un porcentaje máximo de inhibición cercano al 30%, dentro del rango de concentraciones evaluado. Por el contrario, QE-ME demostró una tendencia creciente en su capacidad de eliminación del radical DPPH, con valores de inhibición que aumentaron progresivamente hasta alcanzar un máximo de inhibición cercano al 92% con la concentración más alta estudiada (40 g L-1). Este resultado fue comparable al obtenido con el control positivo (ácido ascórbico), con el que se consiguió un 93% de inhibición. Esto demostró que QE-ME presentó una significativa capacidad antioxidante.
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