Die Bedeutung von Atf6 für die Zebrafischretina: Generierung und Charakterisierung eines atf6-/- - Zebrafischmodells

Mutationen im ATF6-Gen verursachen autosomal rezessive Achromatopsie beim Menschen. Alle bisher mit Achromatopsie assoziierten Gene kodieren für funktionelle Bestandteile der Phototransduktionskaskade im Zapfen-Photorezeptor. Im Gegensatz dazu besitzt ATF6 keine spezifische oder exklusive Funktion in der Phototransduktion. ATF6 kodiert für den ubiquitär exprimierten Aktivierenden Trankriptionsfaktor 6, der eine bekannte Schlüsselfunktion bei der Regulation der UPR und der zellulären Homöostase des ERs spielt. Warum ATF6 als ubi-quitär exprimierter Transkriptionsfaktor in seiner mutierten Form ausschließlich zu einem retinalen Phänotyp im Menschen führt, sollte in dieser Arbeit unter Verwendung eines eigens generierten Zebrafischmodells untersucht werden. Da bislang nicht untersucht wurde, wo atf6 in der Retina exprimiert wird, wurden ISH-Experimente zur Lokalisation von atf6 in der Zebrafischlarve durchgeführt. atf6 konnte in sich in der Entwicklung befindenden Photorezeptoren, in Amakrinzellen und in Zellen der peripheren, der CMZ zugewandten Bereichen der Ganglienzellschicht sowie der CMZ in der larvalen Zebrafischretina lokalisiert werden. Vergleicht man im Alter von 3 dpf die Lokalisa-tion der Expression von atf6 mit der der atf6 Zielgene hspa5 und hspa90b1 sowie von atf6β, zeigten sich teilweise überlappende Expressionsmuster aller Zielgene. Mittels dieser Ergeb-nisse konnte gezeigt werden, dass die UPR während der retinalen Entwicklung aktiv und von Bedeutung ist. Um Informationen über den Pathomechanismus der ATF6-assoziierten Achromatopsie zu erhalten, wurde mithilfe der TALEN-Technologie ein atf6-/--Zebrafischmodell generiert, wel-ches eine Deletion in Exon 6 des atf6-Gens (c.519delG;p.V174fs*42) trägt. In vorherigen in silico Analysen wurde zudem sicher gestellt, dass atf6 nur einmal im gesamten Zebrafischge-nom vorliegt und nicht im Zuge der Genom-Duplikation während der Entwicklung der Teleostei dupliziert wurde. Die Charakterisierung des Fischmodells erfolgte über immunhistologische Färbungen sowie funktionelle Untersuchungen. Die histologische Analyse zeigte eine im frühen Larvenstadium auftretende, durch den Verlust von atf6 bedingte, retinale Entwicklungsverzögerung, die sich mit fortschreitendem Alter wieder zurückbildete. Die Entwicklungsverzögerung betraf alle Schichten der Retina und äußerte sich in Form einer verminderten Zahl an Zapfen-Photorezeptoren, Bipolarzellen sowie Ganglienzellen. Elektroretinographische Untersuchun-gen zeigten, dass die visuelle Funktion in atf6-defizienten gegenüber wildtypischen Larven eingeschränkt ist. Untersuchungen, die Auskunft über das Proliferationspotential und die Zell-todrate geben und damit eine mögliche Erklärung für die verminderten Zellzahlen in der atf6-defizienten Retina aufzeigen sollten, lieferten keine Hinweise auf ein verändertes Proliferati-onsverhalten oder eine gesteigerte Zelltodrate in der atf6-defizienten Retina. Ob der Verlust von atf6 in einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber UPR-induzierender Substanzen resultiert und der retinale Phänotyp in atf6-defizienten Zebrafischlarven hierdurch intensiviert wird, wurde an mit Tunicamycin-behandelten Zebrafischlarven untersucht. Die histologische Ana-lyse der behandelten wildtypischen und atf6-defizienten Larvenretinae zeigte, dass die phar-makologische Induktion der UPR mittels Tunicamycin lediglich einen Einfluss auf die Zahl der Bipolarzellen in der atf6-defizienten im Vergleich zur wildtypischen Retina ausübt. Diese waren in der atf6-defizienten gegenüber der wildtypischen Retina in ihrer Zahl im Alter von 5 dpf reduziert. Die Zahl der Zapfen-Photorezeptoren als auch die Zahl der Ganglienzellen blieb trotz der Tunicamycin-Behandlung unverändert. Um zu überprüfen, ob der Verlust von atf6 die Expression von Zielgenen der UPR, wie hspa5 und hsp90b1 aber auch atf6β beeinflusst, wurden Expressionsanalysen mittels qRT-PCR-Experimenten im Larvalstadium (3 dpf und 5 dpf) und der adulten Zebrafischretina durchge-führt. Im Alter von 3 dpf und 5 dpf wurden keine Unterschiede in der Expression der atf6-Zielgene hspa5 und hsp90b1 detektiert. Die Expression von atf6β war in den untersuchten Larvalstadien jedoch signifikant erhöht, was auf einen kompensatorischen Mechanismus von atf6β bei vorliegendem Verlust von atf6 während der Entwicklung des Zebrafisches hinweist. Abschließend ist festzustellen, dass Atf6 eine Rolle in der retinalen Entwicklung spielt, das atf6-/--Zebrafisch-Model jedoch leider kein geeignetes Model für die ATF6-assoziierte ACHM beim Menschen darstellt.

Author

• Felden, Julia

Identifier

hdl:10900/94406

OAI record oai:identifier

https://publikationen.uni-tuebingen.de/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=mets&identifier=oai%3Apublikationen.uni-tuebingen.de%3A10900%2F94406