Multiplexe serologische Assays zur Analyse der humoralen Immunantwort auf das Hepatitis C Virus Genotyp 4

Hepatitis C ist eine durch das Hepatitis C Virus verursachte Lebererkrankung und zeigt global sehr unterschiedliche Prävalenzen. Die Verbreitung der sieben HCV Genotypen unterscheidet sich ebenfalls geografisch sehr stark. In Ägypten beträgt die Prävalenz für eine aktive HCV Infektion 10 % und die Seroprävalenz 15 % [32]. Außerdem ist Ägypten weltweit das Land mit der höchsten Prävalenz von HCV Genotyp 4 [33]. Zur Vermeidung von Folgeerkrankungen wie Zirrhosen und Hepatozellulären Karzinomen wird eine Eradikation des Virus angestrebt. Falls eine Eradikation während der akuten Infektionsphase nicht spontan erfolgt, kann eine antivirale Therapie eingeleitet werden, die inzwischen in über 90 % der Fälle erfolgreich ist [47]. Der HCV Status (akut oder chronisch) kann daher bei der Entscheidung, eine antivirale Therapie einzuleiten, eine wichtige Rolle spielen. In dieser Arbeit wurden zwei multiplexe serologische Assays zum Nachweis von anti-HCV Antikörpern der Klasse G und der Klasse M in humanen Proben entwickelt und validiert. Der multiplexe Mikrosphären-basierte serologische Assay kombiniert hierbei die Vorteile von zwei etablierten HCV Diagnostiktests: Zum einen die Durchführung des Assays im klassischen 96-Well Mikrotiterplatten Format, mit dem eine große Anzahl von Proben parallel und schnell vermessen werden können, zum anderen können mit dem Mikrosphären-basierten Assay – wie beim Line-Immunoassay – mehrere Antigene parallel im Assay verwendet werden, wodurch die Reaktivitäten gegenüber verschiedenen HCV Antigenen differenziell betrachtet werden können. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten serologischen HCV Assays setzten sich aus 27, bzw. 25 verschiedenen HCV Antigenen sowie sechs internen Kontrollen zusammen und benötigten jeweils 5 µl humanes Serum oder Plasma zur Messung der IgG oder IgM Reaktivität. Mit dem anti-HCV-IgG Assay wurde ein gut charakterisierter klinischer Probensatz untersucht, der 117 Proben von Spendern mit HCV Status negativ, 166 Proben von Patienten mit HCV Status akut und 141 Proben von Patienten mit HCV Status chronisch beinhaltete. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der anti-HCV-IgG Assay im Vergleich mit der klinischen Klassifizierung eine hohe diagnostische Spezifität (100 %) und Sensitivität (96,4 %) aufweist. Der Vergleich mit der EIA Referenzmessung zeigte eine Übereinstimmung der Spezifität und eine etwas bessere diagnostische Sensitivität im multiplexen Mikrosphären-basierten serologischen Assay als im EIA (96,4 % versus 95,2 %). Die Referenzmessung mit dem LIA bestätigte die Anwendbarkeit zur differenziellen Betrachtung von Antikörperreaktivitäten. Das entwickelte Klassifikationsverfahren zur weiteren Unterscheidung von HCV Patienten in „akut“ und „chronisch“ konnte 85,1 % der Proben ihrem HCV Status entsprechend richtig klassifizieren. Diese Art der Klassifizierung bietet die Möglichkeit die klinische HCV Diagnostik zu ergänzen. Die Ergebnisse des anti-HCV-IgM Assays hingegen ergaben, dass sich dieser Assay nicht für die Klassifizierung von HCV Patientenproben eignete. Dennoch konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass im Zusammenhang mit anderen viralen Hepatitis Infektionen eine IgM Detektion durchaus sinnvoll erscheint. Durch die gezielte Verwendung von HCV g4a Antigenen in diesen serologischen HCV Assays, wurde eine detailliertere Untersuchung der humoralen Immunantwort von Patienten mit einer HCV g4 Infektion ermöglicht. Die hierarchische Clusteranalyse der IgG Messung zeigte, dass die Immunprofile der HCV Patienten in vier verschiedene Gruppen eingeteilt werden konnten. Die stärkste Reaktivität lag hier jeweils auf der Core- und NS3-Region, Antikörper gegen Antigene der NS4- und NS5-Region traten meist erst in einer späteren Phase der Serokonversion auf. Die Analyse der Proben von Patienten mit und ohne spontane Eradikation ergab kein spezielles serologisches Immunprofil, das im Zusammenhang mit einer spontanen Eradikation von HCV steht. Bei der Untersuchung von Zeitreihen konnte zunächst festgestellt werden, dass der anti-HCV Antikörpertiter nach spontaner HCV Eradikation absinkt. Die Analyse von Zeitreihen von chronischen HCV g4 Patienten zeigte zudem, dass auch diese Immunprofile nicht statisch sind, denn es konnten auch nach längerer Zeit noch Veränderungen der humoralen Immunantwort beobachtet werden. Nicht nur die Viruslast konnte einen fluktuierenden Verlauf aufweisen, auch die Reaktivitäten gegenüber bestimmten Antigenen zeigten ein ähnliches und z. T. verzögertes Verhalten. Durch multiplexe serologische Assays ist es möglich in einem einzigen Test die Antikörperreaktivitäten auf hunderten von Antigenen zu ermitteln. Solche Tests können zur Detailcharakterisierung von Reaktivitäten gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen dienen und haben langfristig gesehen das Potential, in der Routinediagnostik eingesetzt zu werden.

Author

• Filomena, Angela

Identifier

hdl:10900/68555

OAI record oai:identifier

https://publikationen.uni-tuebingen.de/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=mets&identifier=oai%3Apublikationen.uni-tuebingen.de%3A10900%2F68555