Verbesserung des CVB3-Maus-Myokarditismodells durch die Entwicklung pankreasattenuierter Coxsackieviren
Das Coxsackievirus B3 (CVB3)-Maus-Myokarditismodell wird standardmäßig zur Untersuchung der Virus-induzierten Myokarditis verwendet. Entgegen der CVB3-Infektion im Menschen stellt im murinen Organismus nicht das Herz, sondern das Pankreas das für die CVB3-Infektion suszeptibelste Organ dar. Verschiedene klinische Symptome, wie der starke Gewichtsverlust, das schmerzhafte Hochziehen des Bauches sowie schnell auftretende Todesfälle, können als direkte Folge der virusbedingten akuten Pankreatitis angesehen werden. Diese fulminante Ausprägung der Pankreatitis stellt für die Tiere eine extreme Belastung dar, welche sich von der humanen Präsenz unterscheidet. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Verbesserung des CVB3-Maus-Myokarditismodells durch die Entwicklung einer genetisch modifizierten CVB3-Variante, welche durch die Insertion von microRNA-Zielsequenzen (microRNA-Target Sites, miRNA-TS) eine Pankreasattenuation aufweist. Die Expressionsanalyse von miRNAs im Pankreas und Herz mittels eines Affymetrix miRNA –Chip-Assays sowie quantitativer RT-PCR zeigte, dass die miRNA-375 die stärkste Expression im Pankreas aufwies und nur geringfügig im Herzen exprimiert wird. Darauf basierend wurden drei Kopien der miRNA-375TS in das 3’ -bzw. 5’-Ende des Genoms der CVB3-Variante rCVB3.1, jeweils in positiver bzw. negativer Orientierung, inseriert. Die Analyse der daraus resultierenden vier rekombinanten CVB3-Varianten in vitro zeigte, dass die virale Replikation über die Insertion der miRNA-TS in positiver Orientierung in die 3’-UTR des Genoms (Virusvariante: CVB3-375TS(3+)) am effektivsten durch die miRNA-375 unterdrückt wurde. In der pankreatischen Zelllinie EndoC-βH1 wurde, verglichen mit dem keine TS-Sequenzen enthaltenden Kontrollvirus, die Replikation von CVB3-375TS(3+) durch die endogene miRNA-375 Expression ca. um vier log10-Stufen verringert. In isolierten primären embryonalen Kardiomyozyten wurde CVB3-375TS(3+) hingegen nicht unterdrückt. Für die in vivo Versuche wurden drei Kopien der miRNA-375TS in das 3’-Ende des Genoms der kardiotropen CVB3-Variante H3N inseriert. Es zeigte sich, dass die intraperitoneale (i.p.) Injektion des generierten Virus (H3N-375TS) in NMRI-Mäusen weder eine Pankreatitis noch eine Myokarditis verursachte. Hingegen führte die intravenöse (i.v.) Applikation von H3N-375TS in NMRI- als auch Balb/C-Mäusen zu einer Infektion des Herzens und induzierte je nach Versuchsaufbau eine akute oder chronische Myokarditis ohne Infektion des Pankreas. Während die akute Myokarditis sich durch moderate kardiale H3N-375TS-Titer, die Expression proinflammatorischer Zytokine sowie die Inflammation und die Zerstörung des Herzgewebes auszeichnete, war die chronische Myokarditis durch sehr geringe kardiale H3N-375TS-RNA Level ohne detektierbare Virusreplikation sowie durch die Ausbildung fibrotischer Gewebeareale gekennzeichnet. Ob und welche Rolle das Pankreas für die Ausbildung der Myokarditis in Mäusen spielt wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen nunmehr eindeutig, dass bei der i.p. Applikation von CVB3 das Pankreas essentiell für die kardiale Infektion ist, wohingegen bei der i.v. Applikation eine Myokarditis ohne Infektion des Pankreas durch die mittels miRNA-375TS genetisch modifizierte CVB3-Variante verursacht werden kann. Das H3N-375TS induzierte Modell erlaubt so die Untersuchung der CVB3induzierten Myokarditis in Mäusen unabhängig von einer Pankreasinfektion. Zudem verringerte das pankreasattenuierte H3N-375TS bei NMRI-Mäusen, vor allem aber bei Balb/C-Mäusen, die auf die Pankreatitis zurückführbaren Schmerzen bzw. das Leiden während der CVB3-Infektion. Damit verstärkt es nicht nur die wissenschaftliche Relevanz der Myokarditisanalyse im Mausmodell, sondern es entspricht hinsichtlich der tierschutzrechtlichen Forderungen der 3R-Richtlinien den beiden Aspekten Reduction und Refinement.
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