Funktion, Modifikation und Anwendung von O2-toleranten, NAD(P)+-reduzierenden [NiFe]-Hydrogenasen

Lösliche, NAD(P)+-abhängige [NiFe]-Hydrogenasen („Soluble Hydrogenase“, SH) katalysieren die reversible Spaltung von H2 in jeweils zwei Elektronen und Protonen sowie die damit gekoppelte Reduktion des Pyridinnukleotid-Kofaktors. Die beiden Reaktionen erfolgen in zwei unterschiedlichen Modulen, dem Hydrogenasemodul HoxHY, das das H2-spaltende aktive [NiFe]-Zentrum trägt, und dem flavinhaltigen NAD+-Reduktasemodul HoxFU. Die beiden aktiven Zentren sind über eine Reihe von [FeS]-Zentren elektronisch verbunden. Neben dem H2-Oxidierer Ralstonia eutropha H16 besitzen auch andere Knallgasbakterien wie Rhodococcus opacus und Hydrogenophilus thermoluteolus NAD+-abhängige Hydrogenasen, die aufgrund ihrer ungewöhnlichen Sauerstofftoleranz von besonderem Interesse sind. Für die SH aus Ralstonia eutropha (ReSH) wurde gezeigt, dass sie biotechnologisch für die H2-getriebene Regeneration von NADH eingesetzt werden kann. Allerdings ist die ReSH hochspezifisch für NAD+, während das phosphorylierte Derivat NADP+ nur in Spuren umgesetzt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Substratspektrum der ReSH mithilfe gezielter Mutagenese auf NADP+ erweitert, was zu einer 240-fachen Erhöhung der katalytischen Effizienz für das neue Substrat führte. Die SH-Varianten mit synthetischer NADP+-Reduktionsaktivität wurden eingehend biochemisch und elektrochemisch charakterisiert und ihre Funktionalität in gekoppelten Enzymreaktionen gezeigt. Für die biotechnologische Anwendung der SH sind neben der Substratspezifität noch weitere Eigenschaften wie Thermostabilität und Salztoleranz von Bedeutung. Die heterologe Produktion der SH aus dem thermophilen Organismus Hydrogenophilus thermoluteolus (HtSH) in Ralstonia eutropha und die anschließende Reinigung ermöglichte erstmals eingehende biochemische und spektroskopische Untersuchungen dieser Hydrogenase mit besonderer Thermostabilität. Dabei zeigte sich im Vergleich zur ReSH ein höheres Temperaturoptimum von 80 °C und ein niedrigerer optimaler pH-Wert von 6.5. Infrarotspektroskopische Untersuchungen ergaben, dass auch die Streckschwingungen der für [NiFe]-Hydrogenasen typischen CN-- und CO-Liganden des aktiven Zentrums von denen der ReSH abweichen, was auf alternative Strukturen und/oder Redox-Zustände des aktiven Zentrums hindeutet. Im Falle der HtSH und der SH aus Rhodococcus opacus wurden Ähnlichkeiten hinsichtlich ihrer Reaktivität aufgedeckt. Im Gegensatz zur ReSH zeigten beide Enzyme nur in Anwesenheit von zweiwertigen Kationen wie Ni2+ und Mg2+ im Reaktionsansatz die typische H2-abhängige Reduktion von NAD+. Diese Kationen-Abhängigkeit wurde mit in dieser Arbeit konstruierten SH-Hybriden näher untersucht. Hierfür wurden die Hydrogenase- bzw. NAD+-Reduktase-Module von H. thermoluteolus und R. opacus heterolog in ∆hoxH- bzw. ∆hoxFU-Deletionsstämmen von R. eutropha produziert und durch die jeweiligen R. eutropha-eigenen Module zur vollständigen, chimären SH komplementiert. Durch diese Strategie konnte die Abhängigkeit für die zweiwertigen Ni2+- und Mg2+-Ionen eindeutig den Hydrogenasemodulen von H. thermoluteolus und R. opacus zugeordnet werden. Hybride, die das Hydrogenasemodule aus R. eutropha trugen zeigten H2-getriebene NAD+-Reduktaseaktivität auch ohne Zugabe dieser Kationen. Mit Ausnahme der SH-Variante aus HtHydrogenase und ReNAD+-Reduktase sind alle SH-Chimären in der Lage, autotrophes Wachstum von R. eutropha in einer Atmosphäre aus H2, O2 und CO2 zu vermitteln. Die Funktionalität dieser Hybridtechnik ermöglicht die Anpassung der biochemischen Eigenschaften entsprechend der gewünschten Reaktionsbedingung durch geeignete Modulkombination. Beispielsweise kann die im Vergleich zur ReSH höhere NAD+-Affinität der RoNAD+-Reduktase mit der aktiveren ReHydrogenase kombiniert werden, sodass ein SH-Hybrid entsteht, das im Gegensatz zur RoSH nicht abhängig von Kationen ist.

Author dc:creator

• Preissler, Janina

Advisor dc:contributor.advisor

• Lenz, Oliver

Licence dc:rights.uri

• https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Language dc:language.iso

de

Identifier URI

http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-7446

OAI identifier oai:identifier

oai:depositonce.tu-berlin.de:11303/8295