Structure-function relationships of metalloenzymes

Anhand der Modellsysteme [NiFe] Hydrogenase und Superoxid Reduktase wurden Struktur-Funktionsbeziehungen von Metalloenzymen, die die Umwandlung kleiner Moleküle katalysieren, mittels theoretischer und spektroskopischer Methoden analysiert. Der erste Teil dieser Arbeit ist der Charakterisierung O2-toleranter [NiFe] Hydrogenasen gewidmet, die die reversible Spaltung von H2 in Anwesenheit von O2 katalysieren. Die strukturellen Aspekte aerober H2-Umwandlung wurden hierbei detailliert für die lösliche NAD+-reduzierende [NiFe] Hydrogenase (SH) aus Ralstonia eutropha untersucht. Aufgrund zusätzlicher CN-Streckschwingungsbanden im Infrarot(IR)-Spektrum der isolierten SH wurde in früheren Arbeiten die Sauerstofftoleranz auf eine sterische Abschirmung des scheinbar redoxinaktiven katalytischen Zentrums durch zusätzlichen Cyanidliganden zurückgeführt. Mittels Dichtefunktionaltheorie (DFT) konnte nun gezeigt werden, dass dieses Modell nicht mit den experimentellen Befunden kompatibel ist. In Übereinstimmung mit früheren in vivo spektroskopischen Untersuchungen des Autors können überzählige Cyanidliganden als Erklärung für zusätzliche CN-Streckschwingungsbanden ausgeschlossen werden. Um die eigentliche Ursache dieser ungewöhnlichen IR-Signale aufzuklären, wurde die isolierte SH unter verschiedenen Redoxbedingungen untersucht. Mittels DFT Rechnungen konnten so sämtliche IR-spektroskopischen Eigenschaften der SH auf der Grundlage eines Standard [NiFe] Zentrums sowie dessen reversible Sulfoxigenierung im voll oxidierten Zustand erklärt werden. Auf dieser Grundlage wurde die katalytische Detoxifizierung von Sauerstoff über eine NADH-abhängige, Schwefel-basierte Peroxidasereaktion als neues Modell für die Sauerstofftoleranz der SH vorgeschlagen. Dieses Prinzip bietet einen wertvollen Ansatzpunkt für die Konzipierung entsprechender biomimetischer Katalysatoren, da H2-Konversion und O2-Detoxifizierung hierbei vom selben Cofaktor bewerkstelligt werden. Neben ihrer Sauerstofftoleranz unterscheidet sich die SH von anderen Hydrogenasen auch durch die Kopplung der reversiblen H2-Spaltung an die Redoxumwandlung von NAD(H). Die Gesamtheit der mutmaßlich an dieser Kopplung beteiligten FeS Cluster konnte nun erstmal experimentell mittels Kernresonanzschwingungsspektroskopie (NRVS) nachgewiesen werden. Das Fehlen entsprechender Elektronenspinresonanz (ESR) Signale ist hierbei auf eine nur partielle Reduktion der Cluster durch den nativen Elektronendonor der SH, NADH, zurückzuführen, so dass der langjährige Widerspruch zwischen vorhergesagten und ESR-spektroskopisch detektierten Clustern aufgelöst werden konnte. Der zweite Teil dieser Arbeit führt die Resonanz Raman (RR) Spektroskopie als neue Methode zur strukturellen und funktionalen Charakterisierung des aktiven [NiFe] Zentrums von Hydrogenasen ein. Mit Hilfe theoretischer Methoden konnten Fe-CO/CN und Ni-S Moden eindeutig über charakteristische Isotopenverschiebungen identifiziert werden. Durch die Nutzung dieser Moden als strukturelle Marker für die zugrunde liegenden molekularen Koordinaten gewährte die Theorie-gestützte RR Spektroskopie wertvolle Einblicke in katalytische Intermediate von [NiFe] Hydrogenasen. Es wurde gezeigt, dass die hohen Photonendichten während des RR Experiments die photochemische Bildung von Ni-L aus dem vollständig reduzierten Nia-SR Zustand ermöglichen. Über das experimentelle Spektrum konnte dieses photoinduzierbare Intermediat als Ni(I) Spezies mit einem protonierten terminalen Cystein sowie einer freien Koordinationstelle zwischen den beiden Metallen identifiziert und damit ein Vorschlag aus der Literatur bestätigt werden. In Übereinstimmung mit DFT Rechnungen wurde ein ähnliches Spektrum auch für das H2-bindende Intermediat Nia-S beobachtet, so dass auch für diese Spezies eine freie Koordinationsstelle angenommen werden kann. Experimentelle und theoretische Daten belegen weiterhin, dass Nia-S eine wippenförmige Ni-Geometrie sowie einen elektronischen Ni(II), S = 0 Grundzustand aufweist. Somit konnten über die fundamentalen strukturellen Eigenschaften von Ni-L und Nia-S essentielle funktionelle Determinanten der biologischen H2-Umwandlung erschlossen werden. Superoxid Reduktasen (SOR) sind Nichthäm-Eisenenzyme, die die Reduktion von Superoxid katalysieren und somit ein weiteres wertvolles Modellsystem für die Untersuchung reversibler Interaktionen von Metalloenzymen mit Sauerstoff-Spezies darstellen. Mit Hilfe der IR-Differenzspektroskopie und theoretischer Methoden wurden redoxabhängige strukturelle Änderungen einer SOR detailliert untersucht. Auf diesem Wege wurden die reduktive Dissoziation des Glutamatliganden vom aktiven Zentrum sowie dadurch hervorgerufene Konformationsänderungen einer nahegelegen beta-Schleife, angrenzender Helices sowie entfernter beta-Faltblätter nachgewiesen. Mittels Normalmodenanalyse auf Grundlage eines elastischen Netzwerk-Modells (ENM-NMA) konnten diese Beobachtungen auf eine niederfrequente thermische Mode des gesamten Proteins zurückgeführt werden. Diese ist vermutlich für den definierten strukturellen Übergang zwischen der oxidierten und reduzierten SOR Form und somit für die enzymatische Funktion, z.B. im Rahmen kooperativer Effekte, relevant. Über IR-differenzspektroskopische Untersuchungen wurden auch H/D-insensitive Imidazol-Moden beobachtet, was auf eine metallinduzierte Deprotonierung von Histidinliganden hindeuten könnte. Dies wäre von katalytischer Relevanz, da hierdurch die Redoxeigenschaften des aktiven Zentrums sowie das umgebende Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk beeinflusst würden. Durch experimentelle und quantenmechanische Daten konnte dies jedoch ausgeschlossen werden, d.h. alle Histidinliganden des aktiven Zentrums im Neutralzustand vorliegen. Deren Deprotonierung würde vielmehr die Geometrie des aktiven Zentrums verzerren, so dass der fehlende H/D-Austausch durch eine hohe Reorganisationsenergie erklärt wurde. Durch die Einbeziehung statischer wie dynamischer Aspekte gewährten diese Untersuchungen wertvolle Einblicke in die lokale und globale SOR-Struktur sowie Säure/Base-Eigenschaften koordinierter Histidine und dibasischer Liganden im Allgemeinen.

Author dc:creator

• Horch, Marius

Advisor dc:contributor.advisor

• Hildebrandt, Peter

Licence dc:rights.uri

• http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/

Language dc:language.iso

en, English

Identifier URI

urn:nbn:de:kobv:83-opus4-67940
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4518

OAI identifier oai:identifier

oai:depositonce.tu-berlin.de:11303/4815