Struktur-Funktionsbeziehungen der Na+/K+-ATPase anhand elektrophysiologischer Untersuchungen C-terminaler und Migräne-assoziierter Mutationen

Die Na+/K+-ATPase ist ein Transmembranprotein, das die Gradienten für Na+ und K+ über der Zellmembran aufrecht erhält, indem sie drei Na+-Ionen ins Extrazelluläre und zwei K+-Ionen ins Intrazelluläre unter Verbrauch von ATP transportiert, was von elementarer Bedeutung für die Zellfunktion ist. Eine verminderte Funktion des Enzyms durch Mutationen in der katalytischen α-Untereinheit kann zu neurologischen Erkrankungen führen; wie die familiäre hemiplegische Migräne Typ 2 (FHM2), die durch Gendefekte der vorwiegend in Gliazellen exprimierten α2-Isoform zurückzuführen ist. Anhand der Röntgenkristallstruktur wurde deutlich, dass einige der bisher identifizierten FHM-Mutationen in Bereichen liegen, deren funktionelle Relevanz noch nicht eindeutig aufgeklärt wurde. In dieser Arbeit wurden FHM-Mutationen untersucht, die sich an möglichen Interaktionsstellen zwischen der katalytischen α- und der regulatorischen β-Untereinheit befinden. Der Schwerpunkt lag aber auf Mutationen im C-terminalen Bereich der α-Untereinheit, wobei nicht nur auf FHM-Mutationen fokussiert wurde, sondern auch auf Mutationen von Aminosäureresten, die eine wichtige Rolle beim Ionentransport spielen könnten. Zwischen den beiden C-terminalen Resten (Tyr1019, Tyr1020) und der mutmaßlichen dritten Na+-Bindungsstelle befindet sich eine durch polare und geladene Reste gebildete intrazelluläre Kavität. Nach neueren Erkenntnissen könnte diese Kavität einen intrazellulären Zugang für Na+-Ionen oder auch H+-Ionen bilden. Durch ihren elektrogenen Transportzyklus kann die Na+/K+-ATPase elektrophysiologisch untersucht werden. In dieser Arbeit wurde die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik an Oozyten des südafrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis angewendet, um Details im Reaktionszyklus der Na+/K+-ATPase aufzuklären, vor allem hinsichtlich der Frage, wie der C-Terminus den intrazellulären Zugang zur dritten Na+-Bindungsstelle für Protonen reguliert. Des Weiteren sollten Kenntnisse über die Interaktionen zwischen der β- und der α-Untereinheit erlangt und funktionelle Mechanismen, die zur Ausbildung einer hemiplegischen Migräne (HM) führen, besser charakterisiert werden. Für einige HM-Mutanten wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass sie nicht in die Plasmamembran gelangen (Y1009X, L994del und G855R). Weitere HM-Mutationen (G900R, E902K und K1003E) zeigten keine funktionellen Abweichungen. Die Mutante R1007W, die kürzlich sowohl mit dem Auftreten von FHM2 als auch von Epilepsie in Verbindung gebracht werden konnte, wies eine niedrigere apparente K+-Affinität auf, was für die Ausbildung einer Migräne physiologisch relevant sein könnte. Die hier gewonnenen Daten zu Mutationen an mutmaßlichen Interaktionsstellen mit der β-Untereinheit gaben allerdings keine Informationen darüber, ob und wie diese Interaktionen gestört sein könnten. In Abwesenheit von extrazellulärem Na+ und K+ zeigt die Na+/K+-ATPase ouabainsensitive, einwärtsgerichtete Leckströme, die bei negativen Potentialen stark vom extrazellulären pH abhängig sind. Der Mechanismus dieser von Protonen getragenen Ströme ist bisher nicht verstanden. Die hier untersuchten C-terminalen Mutationskonstrukte ΔYY, R937L, R937S, D999H und R1002Q zeigten pH-abhängig große ouabainsensitive Leckströme, auch in Na+-haltigen Lösungen, die aber durch K+ inhibiert wurden. Diese Aminosäurereste stehen im Verdacht, an einem C-terminalen Zugangskanal für Protonen zur dritten Na+-Bindungsstelle beteiligt zu sein. Daher wurden die Leckströme unter verschiedenen ionischen Bedingungen untersucht. R937S und R937L vermittelten diese Ströme in beide Richtungen mit pH-abhängigen Umkehrpotentialen. Die Auswertung dieser Leckströme deutete auf einen passiven, protonenselektiven Transportmechanismus hin, der jedoch einen Konformationswechsel des Enzyms erfordert. Unter K+-freien Bedingungen vermittelt die Na+/K+-ATPase einen elektrogenen Na+/Na+-Austausch. Die Untersuchung der daraus resultierenden transienten Ströme enthält Informationen zum Mechanismus dieses Na+-Transports. Bei den Konstrukten ΔYY, R937S, D999H und R1002Q war die Spannungsabhängigkeit der Kinetik des Na+/Na+-Austauschs erheblich verändert. Die Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass der Na+-okkludierte Zustand und der Zugang von Na+ zu diesem Zustand bei diesen Konstrukten destabilisiert sein könnte. Des Weiteren untermauern diese Daten die These, dass die dritte Na+-Bindungsstelle intrazellulär für Protonen zugänglich ist und dass dieser Zugang durch den C-Terminus kontrolliert wird. Auch zeigte sich, dass Arg937 durch die Wechselwirkung mit den C-terminalen Tyrosinen und Arg1002 die Zugänglichkeit für Protonen von beiden Seiten der Membran kontrolliert. Wie sich dieser Zugang mechanistisch gestalten könnte, wurde anhand von Daten aus anderen Mutationsstudien und molekulardynamischen Simulationsstudien diskutiert.

Author dc:creator

• Spiller, Susan

Advisor dc:contributor.advisor

• Friedrich, Thomas

Licence dc:rights.uri

• https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/

Language dc:language.iso

de, German

Identifier URI

urn:nbn:de:kobv:83-opus-39614
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3589

OAI identifier oai:identifier

oai:depositonce.tu-berlin.de:11303/3886