Application of Surface Enhanced Raman Spectroscopy to Biological Systems

In dieser Arbeit wurden die Resonanz-Raman-Spektroskopie (RR-Spektroskopie) sowie die oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Spektroskopie (SERR-Spektroskopie) verwendet, um biologische Systeme, insbesondere Hämproteine, zu untersuchen. Der elektronische Übergang der Hämgruppe kann ausgenutzt werden, um über gezielte Lichtanregung ausschließlich stark verstärkte Raman-Streusignale des Kofaktors zu erhalten. Adsorbiert an aufgerauten Silberelektroden kommt der Oberflächenverstärkungseffekt zum Tragen, der es ermöglicht, Proteine selbst bei Submonolagen-Beschichtung zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektrode die Ansteuerung von Oberflächenredoxreaktionen, was ausgenutzt werden kann, um Informationen über die Redox-Eigenschaften und Dynamik von Hämproteinen zu erhalten. Dieser experimentelle Ansatz wurde verwendet, um die Elektronentransferkinetik des Proteins Cytochrom c - ein kleines, redox-aktives Hämprotein in der mitochondrialen Atmungskette – zu untersuchen. Cytochrom c wurde dafür auf einer rauen Silberelektrode, beschichtet mit einer biomimetischen Monoschicht aus carboxyl-terminierten Alkanthiolen, immobilisiert und mit stationärer und zeitaufgelöster SERR-Spektroskopie untersucht. Besonderes Augenmerk wurde auf die Elektronentransfereigenschaften des Proteins bei kleinen Abständen zur Elektrode gelegt. Die Ergebnisse der Untersuchungen geben neue Aufschlüsse über den heterogenen Elektronentransfer und deuten dabei auf eine besondere Rolle des elektrischen Feldes an Grenzflächen hin. Dieses beeinflusst die Oberflächenorientierungsdynamik, die Elektronentunnel-Wahrscheinlichkeit und die Umstrukturierung der Wasserstoffbrückennetzwerke des Protein und an der Grenzfläche. Neben der Rolle als Elektronenüberträger in der Atmungskette fungiert Cytochrom c ebenso als Signalprotein in der Apoptose, dem programmierten Zelltod. Dafür muss es die mitochondriale Membran, an die es normalerweise gebunden ist, verlassen und ins Zellplasma übergehen. Die Ursache für diese Migration ist noch weitestgehend ungeklärt. Als ein Faktor, der den damit verbundenen Verlust an Redox- und die Zunahme an Peroxidase-Aktivität erklärt, wird die post-translationale Nitrierung von Tyrosinresten des Proteins diskutiert. Folglich wurde mittels RR-Spektroskopie der Einfluss von post-translationaler Tyrosin-Nitrierung auf die Integrität der Hämtasche untersucht. Es zeigte sich, dass die Destabilisierungen, hervorgerufen durch die Nitrierung verschiedener Tyrosinreste, nicht mit der jeweiligen gesteigerten Peroxidase-Aktivität korrelieren. Experimente, bei denen die verschiedenen Tyrosin-Mutanten auf eine Elektrode adsorbiert wurden, zeigten außerdem, dass die Grenzflächen bedingte Destabilisierung der Hämtasche unabhängig von der Nitrierung wirkt. Des Weiteren wurde die Anwendbarkeit der zeitaufgelösten SERR-Spektroskopie zur kinetischen Untersuchung von Biofilmen des Bakteriums Geobacter Sulfurreducens demonstriert. Dies ist möglich, da das Bakterium eine Reihe von Multihämproteinen, sogenannten "outer membrane cytochromes" (Omcs), besitzt, die für den extrazellulären Elektronentransfer verantwortlich sind. Besonders stark sind diese Cytochrome an der Grenzfläche zwischen Biofilm und Elektrode akkumuliert. Durch Anwendung von stationärer und zeitaufgelöster SERR-Spektroskopie konnte die besondere Rolle der Omcs als "Elektronenschleuse" zwischen Biofilm und Elektrode nachgewiesen und eine gemittelte heterogene Elektronentransferratenkonstante bestimmt werden. Weiter deuten die Experimente zusammen mit kinetischen Simulationen darauf hin, dass der heterogene Elektronentransfer der geschwindigkeitsbestimmende Schritt beim Elektronenaustausch Biofilm-Elektrode ist. Der letzte Teil der Arbeit ist der methodischen Entwicklung der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie zur Ausdehnung auf Nicht-Münzmetalle gewidmet. Dazu wurde eine Pt-Ag-Hybrid-Elektrode konstruiert, die aus einem nanoskopisch rauen Silberuntergrund, welcher zuerst mit einem dielektrischen Material beschichtet und anschließend mit einem Platinfilm überzogen wurde. Während der abgeschottete Silberuntergrund für die notwendige Oberflächenverstärkung sorgt, laufen an der Pt-Oberfläche die zu untersuchenden Grenzflächenreaktionen ab. Die Hybrid-Elektrode wurde in Bezug auf ihre Stabilität und ihre Signalverstärkungseigenschaften bei verschiedenen Wellenlängen untersucht. Die Resultate zeigen, dass starke Raman-Signale von Probenmolekülen, adsorbiert auf der äußeren Pt-Schicht, erhalten werden können. Die Signale sind nur geringfügig schwächer im Vergleich zu einer direkten Adsorption auf Ag.

Author dc:creator

• Ly, Hoang Khoa

Advisor dc:contributor.advisor

• Hildebrandt, Peter

Licence dc:rights.uri

• http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/

Language dc:language.iso

en, English

Identifier URI

urn:nbn:de:kobv:83-opus-38762
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3531

OAI identifier oai:identifier

oai:depositonce.tu-berlin.de:11303/3828