Investigation of the antibacterial activity and the biosynthesis gene cluster of the peptide antibiotic feglymycin
Feglymycin ist ein aus Streptomyces sp. DSM 11171 isoliertes, lineares 13mer-Peptid, das zu einem hohen Anteil aus den nicht-proteinogenen Aminosäuren Hpg (4-Hydroxyphenylglycine) und Dpg (3,5-Dihydroxyphenylglycine) besteht. Zudem besitzt es eine interessante, alternierende Abfolge von D- und L- Aminosäuren und strukturelle Ähnlichkeiten mit den Glycopeptiden der Vancomycin-Gruppe von Antibiotika und den Glycodepsipeptid-Antibiotika Ramoplanin und Enduracidin. Außerdem besitzt Feglymycin eine interessante Bioaktivität. Es wirkt in vivo antibakteriell gegen MRSA-Stämme (multi-resistente Staphylococcus aureus Stämme) und inhibitiert in vitro die Replikation von HIV-Viren im Zellkulturtest. Aufgrund seiner molekularen Masse und strukturellen Ähnlichkeit mit bekannten Zellwandbiosynthese-Inhibitoren wie z.B. Vancomycin und Ramoplanin, wurde auch Feglymycin als Zellwandbiosynthese-Inhibitor getestet. In diesen Tests zeigte Feglymycin keinen Effekt auf die membran-gebundenen zweite und die dritte Stufe der Peptidoglycanbiosynthese. Jedoch deuteten die Experimente auf eine Inhibition der früheren Biosyntheseschritte hin. Ziel dieser Arbeit war es, die antibakterielle Wirkung von Feglymycin auf die bakterielle Zellwandbiosynthese im Detail zu untersuchen und das biologische Target zu identifizieren. Zusätzlich wurde das Feglymycin Biosynthese-Gencluster untersucht. In LC-MS „one-pot assays“ wurde die Wirkung von Feglymycin auf die isolierten E. coli-Enzyme MurA-F getestet. Hierbei konnte reproduzierbar gezeigt werden, das Feglymycin die Enzyme MurA (Enopyruvyl-UDP-GlcNAc Synthase) und MurC (UDP-N-Acetyl-muramyl-L-alanin Ligase) inhibiert. In spektrophotometischen Assays mit den E. coli-Enzymen MurA und MurC konnte ein Ki-Wert von 0.33 +/- 0.04 μM für das MurC Enzym und ein Ki-Wert von 3.4 +/- 1.1 μM für das MurA Enzym bestimmt werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Feglmycin auch die MurA (IC50 = 3.5 +/- 1.3 μM) und MurC (IC50 = 1.0 +/- 0.6 μM) Enzyme des gram-positiven Bakteriums Staphylococcus aureus inhibiert. Feglymycin zeigte dabei eine nicht-kompetitive Inhibition gegenüber der Bindung der Substrate des MurA Enzyms PEP (Phosphoenolpyruvat) und UDP-GlcNAc (UDP-N-Acetylglucosamin) und der Substrate des MurC Enzyms UDP-MurNAc (UDP-N-Acetylmuramat), ATP (Adenosintriphosphat) and L-Alanin. Feglmycin ist daher der erste Naturstoff der das MurC Enzym inhibiert. Zudem zeigt Feglymycin einen nicht-kompetitive Inhibitionstyp. Circulardichromismus (CD) Experimente mit den isolierten E. coli-Enzymen MurA und MurC und Feglymycin deuten einen möglichen allosterischen Effekt des Inhibitors auf die Enzyme an. Zusätzlich wurde die Feglmycinproduktion durch den Stamm Streptomyces sp. DSM 11171 und die Feglymycin-Detektion mittels LC-MS optimiert. Durch die Sequezierung des Genoms von Streptomyces sp. DSM 11171 konnte das Feglymycin Biosynthese-Gencluster identifiziert werden. Bei der Annotation des Genclusters zeigte sich, dass es sich bei Feglymycin um ein nicht-ribosomal synthetisiertes Peptid (NRPS) handelt dessen Biosynthese der Biosynthese der Glycopeptidantibiotika der Vancomycin-Gruppe von Antibiotika ähnelt. Zudem konnten im Streptomyces sp. DSM 11171 Genom weitere NRPS und Polyketidsynthase (PKS) Gencluster identifiziert und annotiert werden.
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