Analyses of hematopoiesis and lineage commitment from ES and iPS cells
Die Kultivierung embryonaler Stammzellen (ES Zellen) und ihre Differenzierung zu verschiedenen Arten hämatopoietischer Zellen in vitro wurde optimiert und standardisiert, um eine zeitlich definierte, quantitativ auswertbare zelluläre Entwicklung zu verfolgen.Diese standardisierten in vitro-Zellkultursysteme ermöglichten eine quantitative Analyse der Kapazitäten verschiedener ES- und iPS-Zelllinien, die sich durch die Anzahl der gebildeten erythroiden, lymphoiden und myeloiden Zellen bestimmen ließen. Es war erwartet worden, dass iPS-Zellen, die aus hämatopoietischen Knochenmarkzellen durch ektopische Expression von Sox-2, Oct-4 und Klf-4 generiert worden waren, aufgrund ihres epigenitischen Gedächtnisses in vitro effizienter in hämatopietische Zellen differenzieren als ES-Zellen. Erstaunlicherweise war die Effizienz der Differenzierung von iPS-Zellen im Vergleich zu ES-Zellen zu hämatopoietischen Zellen drastisch reduziert. Dabei wurde entdeckt, dass undifferenzierte als auch differenzierte iPS-Zellen höhere mRNA-Level der iPS-induzierenden Transkriptionsfaktoren Sox-2, Oct-4 und Klf-4 exprimierten als ES-Zellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses standardisierte in vitro-Zellkultursystem dazu benutzt werden kann, langzeitig repopulierende hämatopoietische Vorläuferzellen aus ES-Zellen zu generieren. Die Entwicklung solcher hämatopoietischer Vorläuferzellen wurde durch Transplantation in sublethal-bestrahlte Rag2-/- γC-/--Rezipientenmäuse nachgewiesen. Die vom Donor abstammenden B- und T-lymphoiden und myeloiden Zellen wurden im Knochenmark, im Thymus, in der Milz und im Peritoneum selbst 4 Monate nach Transplantation mittels ihrer spezifischen genetischen Markergene und ihrer Differenzierungsantigene charakterisiert und quantifiziert. Transplantierbare hämatopoietische Vorläuferzellen in der Differenzierungskultur von ES-Zellen konnten nur in einem beschränkten Zeitfenster gefunden werden. Dies ist die erste Studie, in der eine langzeitige Repopulation immunodefizienter Mäuse mit unmodifizierten aus ES-Zellen entwickelten hämatopoietischen Vorläuferzellen gelungen ist. Retrovirale Transduktion von in vitro differenzierenden ES-Zellen mit dem chromatinremodellierenden HOXB4-Gen ermöglichte eine proliferative in vitro-Expansion der hämatopoietischen Vorläuferzellen. Deren Langzeit-Repopulationsvermögen in Knochenmarkstransplantations-ähnlichen Versuchen war nur 2- bis 10-fach geringer als die einer vergleichbaren Menge an normalen Knochenmarkszellen. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Reporter-ES-Zelllinien generiert, die bacterial artificial chromosomes (BACs) tragen, welche YFP unter Kontrolle des preTα-Promotors und GFP unter Kontrolle des λ5-Promotors exprimieren. Die Analyse der in vitro-Differenzierung zu B- und T-lymphoiden Zellen zeigte, dass BAC λ5-GFP-transgene ES-Zellen das GFP-Markergen exprimieren, wenn sie zu preB-Zellen wurden, aber nicht, wenn sie sich zu preT/T-Zellen entwickelten. Im Gegensatz dazu exprimierten BAC preTα-YFP-transgene ES-Zellen YFP vom DN3-Stadium der T-Zellentwicklung an, wenn sie auf OP9-DL1-Stromazellen in Medium mit IL-7 und Flt-3L differenziert wurden. Dagegen blieben sie YFP-, wenn sie in B220+/CD19+ B-lymphoide Zellen auf OP9-Stomazellen in Medium mit IL-7 und Flt-3L differenziert wurden. BAC preTα-YFP-transgene Mäuse wurden durch pronukleäre Injektion des Reportergenkonstruktes erzeugt. Diese Mäuse wurden dann mit vorhandenen λ5-huCD25-transgenen Mäusen gekreuzt und deren Knochenmark und Thymus auf Reportergen-positive Zellen untersucht. Die einzelne Expression von YFP in den doppelt-transgenen Reportermäusen markiert Vorläuferzellen auf dem Weg zur T-Zell-, aber nicht zur B-Zellentwicklung, während huCD25 umgekehrt Zellen auf dem Weg zur B-Zellentwicklung charakterisieren. YFP+ huCD25+ doppelt-exprimierende Zellen wurden in Knochenmark und Thymus gefunden, aber können weder in Richtung B- noch in Richtung T-Zell-Potential proliferieren.
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