Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zum Typ IV Sekretion-ähnlichen System (T4SLS) des konjugativen Antibiotikaresistenzplasmids pIP501 in Enterococcus faecalis
In den letzten Jahren hat die Resistenz von Bakterien gegenüber Antibiotika so massiv zugenommen, dass die Bakterien immer lebensgefährlicher geworden sind. Der konjugative Plasmidtransfer stellt einen der wichtigsten Mechanismen für die Ausbreitung der Antibiotikaresistenzen in den Bakterien dar. Während die Konjugation in Gram-negativen (G−) Bakterien sehr intensiv untersucht worden ist, weiss man sehr wenig über die Mechanismen des konjugativen Plasmidtransfers in Gram-positiven (G+) Bakterien. Die Konjugation in G+ Bakterien wurde in dieser Arbeit am Beispiel des Multiresistenzplasmids pIP501 untersucht. pIP501 kodiert für drei Proteine ORF5, ORF7 und ORF10, die sehr große Ähnlichkeit mit Typ IV Sekretionskomponenten aus dem G− Bakterium Agrobacterium tumefaciens zeigen. In dieser Arbeit wurden die Protein-Protein Wechselwirkungen der pIP501-Transferproteine (Tra) in vivo und in vitro untersucht. Für die in vivo Studien wurden die 15 tra-Gene der pIP501-Transferregion in die Yeast Two-Hybrid (Y-2H) Plasmide pBTM117c und pGAD426 kloniert und in Saccharomyces cerevisiae L40ccU Hefezellen transformiert. Die Protein-Protein Wechselwirkungen wurden mit dem Y-2H System untersucht. Die Y-2H Studie ergab 18 Protein-Protein Wechselwirkungen. Die Intensitäten der in vivo Interaktionen wurden mit einem quantitativen β-Galaktosidase Assay gemessen. Für die in vitro Protein-Protein Wechselwirkungsstudien wurden die 15 tra-Gene in die Expressionsplasmide pQTEV, pGEX-6P-2 oder pMAL-c2x kloniert. Die Tra Proteine wurden als His-, GST- oder MBP-Fusionsproteine in E. coli Zellen exprimiert und solubilisiert. Protein-Protein Bindungsstudien zwischen den solubilisierten Proteinen wurden durchgeführt und die entsprechenden Proteinkomplexe wurden mittels Affinitätschromatographie isoliert und immunologisch mit Western Blot nachgewiesen. Anhand der in vivo und in vitro Ergebnisse und der Computervorhersagen für die Lokalisierung der Tra Proteine wurde eine Protein-Protein Interaktionskarte für die pIP501 Transferproteine erstellt. Für die Proteine ORF5 und ORF10 wurden ATP-Bindung-/Hydrolyse Studien durchgeführt. ORF5 und ORF10 konnten ATP in vitro binden und hydrolysieren. Mittels einer modifizierten Zymogramm Methode wurde lytische Transglykosylase Aktivität für ORF7 und die ORF7 Domänen SLT und CHAP nachgewiesen. Zusätzlich zum Hauptthema „Konjugativer Transfer in G+ Bakterien“ wurden Protein-Protein Wechselwirkungen zwischen ausgewählten Virulenzproteinen des pathogenen Bakteriums Enterococcus faecalis V583 und humanen Proteinen mittels eines automatisierten Yeast-Two-Hybrid Systems untersucht. Es konnten keine Interaktionen zwischen den Virulenzproteinen und den humanen Proteinen festgestellt werden.
Networked Digital Library of Theses and Dissertations