Herstellung und Charakterisierung von antimykotisch wirksamen Peptiden aus der AFP-Familie der Ascomycota

Die sehr variable und große Gruppe der antimikrobiellen Peptide, von der mehr als 10.000 Vertreter in der Datenbank „Collection of anti-microbial peptids“ CAMPR3 [1] gelistet sind, steht schon lange als potenzielle Basis für Wirkstoffe im Fokus der Forschung. Es gibt auf Grund steigender Zahlen von Pilzinfektionen und Resistenzen gegen antimykotische Wirkstoffe ein großes Bedürfnis diese Quelle zu erschließen. Die Mitglieder der AFP-Familie sind auf Grund ihrer Spezies-Spezifität, besonders auch für bekannte human- und pflanzenpathogene Pilze mit hohem Bedrohungspotential, ohne bekannte Nebenwirkungen von Interesse. In dieser Arbeit wurden daher Grundlagen zur Etablierung des antimykotischen Proteins AFP aus A. giganteus ausgearbeitet. Dazu gehören (i) verbesserte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung, (ii) die Charakterisierung des Wirk-Mechanismus und (iii) in silico Analysen zur Identifizierung der Mitglieder der AFP-Familie. Die Etablierung der Bioreaktorkultivierung, mit standardisierter Ausbeute von 10 mg/L Kulturmedium des AFPs, bildet den Anfang der Arbeit. Vom nativen Produzenten A. giganteus werden mehrere AFP-Varianten sekretiert, welche schwer voreinander zu trennen sind. Aus NMR Versuchen ergab sich, dass durch die sequenzielle Prozession zusätzlich zur längeren AFP Variante „lf“-AFP eine kürzere Variante, das „sf“-AFP (-Alanin), gebildet wird. Die heterologe Expression in P. pastoris ist daher der geeignetste Ansatz für die AFP Produktion, die homologe Herstellung in A. giganteus ermöglicht die Funktion anderer AFP-Varianten aufzuklären. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der C3-Sättigung von Glycosylceramiden auf die Wirksamkeit des AFPs untersucht. Die für Pilze eigenen Strukturmerkmale dieser Membranbestandteile können das spezifische Wirkspektrum des AFPs erklären. Es zeigte sich, dass die 2-Hydroxy Fettsäure N-Acyl-Δ3(E)-Desaturase für die Bildung der Doppelbindung zwischen dem dritten und vierten Kohlenstoffatom des Fettsäurerestes verantwortlich ist. Die Deletion dieses Enzyms führte zur Verringerung der Empfindlichkeit von A. niger oder F. graminearum gegen AFP. Die Expression des Enzyms in P. pastoris lässt einen AFP-sensitiven Stamm entstehen. Es konnte daher die Interaktion von AFP mit den Glycosylceramiden der pilzlichen Membran gezeigt werden. Im dritten Teil der Arbeit wurden Transkriptomdaten von A. niger, der ein anderes Mitglied der AFP-Familie, das AnAFP, sekretiert ausgewertet. Die Erstellung eines anafp-Ko-Expressionsnetzwerks ermöglichte die Zuordnung des AnAFP zu metabolischen Prozessen. Die in silico vorhergesagte Beteiligung des anafp wurde in Laborexperimenten überprüft, wodurch sie bestätigt werden konnte. Es fanden sich deutliche Hinweise für eine zellinterne Rolle des AnAFPs. Im letzten Teil der Arbeit konnten durch in silico Analysen über 50 AnAFP Orthologe in Ascomycota identifiziert werden. Hochkonserviert sind die Anzahl und Positionen der Cysteine sowie des „γ-cores“. Dabei handelt es sich um ein evolutionsbiologisch konserviertes dreidimensionales Strukturmotiv, welches Wechselwirkungen mit Membranen eingeht

Author dc:creator

• Paege, Norman

Advisors dc:contributor.advisor

• Meyer, Vera
• Jung, Sascha

Licence dc:rights.uri

• https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Language dc:language.iso

de

Identifier URI

http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-9554

OAI identifier oai:identifier

oai:depositonce.tu-berlin.de:11303/10627