Development and applications of E. coli immunosensor

Iga aastaga muutuvad keskkonna kvaliteet ja puhtus maailmas aina olulisemaks. Üks tähtsamaid küsimusi on inimeste ligipääs puhtale veele. Kui tavaliselt mõeldakse selle all eelkõige joogivett, siis sama oluline on ka suplusvee puhtus ja ohutus. Üheks vee kvaliteedi parameetriks on tema mikrobioloogiline ohutus, mille hindamiseks kasutatakse teatud bakteriliike, ehk indikaatorliike, mille olemasolu ja arvukuse järgi hinnatakse vee kvaliteeti. Üheks levinumaks indikaatorliigiks vees on Escherichia coli ehk soolekepike. Mõned E. coli tüved võivad olla ka patogeensed. Tavaliselt hinnatakse E. coli arvukust mikrobioloogilistel meetoditel, kultiveerides proove spetsiaalsetel söötmetel, kuid see on aeganõudev. Molekulaarsed meetodid (PCR) on küll kiiremad, kuid nõuavad keeruka aparatuuri kasutamist ning on tundlikud võimaliku saastuse ja proovide maatriksist tuleneva inhibitsiooni suhtes. Doktoritöö eesmärgiks oli välja töötada immunobiosensorsüsteem E. coli tuvastamiseks ning testida selle biosensori rakendamise võimalusi looduslike veeproovide ja kliiniliste uriiniproovide analüüsil. Kasutatud biosensori bioloogiline äratundmiskomponendina kasutati fluorestsentsmärgisega konjugeeritud anti - E. coli ankeha. Analüüsi kõrge tundlikkus saavutati tänu proovis leiduva E. coli sidumisele ühekordse kasutusega mikrokolonnile ning seondunud bakterite spetsiifilisele detekteerimisele. Erinevatest allikatest pärinevates proovides saadud analüüsitulemusi võrreldi alternatiivsete E. coli määramismeetodite, mikrobioloogilise külvi ja kvantitatiivse PCR abil saadud tulemustega. Nimetatud metoodikad võimaldavad küll kõik hinnata E. coli arvukust, kuid mõõdavad erinevaid rakku iseloomustavaid suurusi. Mikrobioloogiliste külvide meetod võtab arvesse elusaid kultiveeritavid rakke; kvantitatiivne PCR hindab E. coli genoomse DNA kogust (elusad + mitte-kultiveeritavad ja surnud rakud), ning biosensor mõõdab E. coli mebraanivalkude kontsentratsiooni proovis. Mõõtes näiteks ühte ja sama veeproovi kirjeldatud meetoditega selgus, et oodatult kõige madalama tulemuse andis mikrobioloogiline meetod (40 korda madalam, kui biosensor), ning ka qPCR meetod andis keskmiselt 4 korda madalama tulemuse kui biosensor. Töö selgitati välja põhjused, mis selliseid erinevusi põhjustasid. Esiteks, biosensoris põhjustasid mõõdetava signaali ka rakkude mehhaanilisel ja keemilisel töötlemisel saadud rakumembraanide fragmendid. Teise olulise tulemusena selgus, et biosensoris kasutatava antikeha äratundmisreaktsioon oli komplekses mikrobioloogilises keskkonnas eeldatust vähem selektiivne. Lisaks E. coli´le on looduslikes keskkondades palju sarnaseid bakteriliike (kolivormseid), millest mõnedel on potentsiaalselt afiinsus immunosensoris kasutatud E. coli antikeha suhtes. Kuna selliste bakterite üldhulk looduslikes vetes võib olla kõrge, siis tuleb biosensori mõõtetulemuste interpreteerimisel arvestada ka nende poolt genereeritava signaaliga. Arvestades erinevate rakufragmentide ning kolivormsete rakkude poolt põhjustatud signaali osakaalu, siis elusate kultiveeritavate E. coli rakkude poolt tingitud signaali osakaal on immunosensori kogusignaalist 10%. E. coli immunosensorit kasutati ka uropatogeense E. coli tuvastamiseks ja kvantiteerimiseks kliinilistes uriiniproovides, kus biosensoriga saadud analüüsitulemused langesid kokku mikrobioloogiliste ja molekulaarsete (qPCR) meetoditega saadud tulemustega. Väljatöötatud biosensorsüsteem võimaldas määrata E. coli sisalduse vee- või uriiniproovides vahemikus 7-107 rakku milliliitris 20 minuti jooksul, mis loob eelduse E. coli automaatseks kohapealseks määramiseks, vältides vajadust proovide transpordiks laborisse ning analüüsile eelnevaks töötluseks.

Author

• Jõgi, Eerik

• biosensors
• Escherichia coli
• fixed methods

Identifier

hdl:10062/83215

OAI identifier oai:identifier

oai:dspace.ut.ee:10062/83215