Abstract
Püruvaat on oluline metabolismi substraat ja seetõttu on püruvaadi kinaaside aktiivsuse regulatsioon oluline raku energia- ja süsinikuvoogude suunamise seisukohast. Maksas, kus samaaegselt toimivad need mõlemad metabolismi rajad, esineb koe-spetsiifiline püruvaadi kinaaas (L-PK), mis on aktiveeritud homotroopselt selle ensüümi substraadi fosfoenoolpüruvaadi (PEP) poolt ning heterotroopselt fruktoos-1,6-bisfosfaadi (FBP) poolt. Samas on need mõlemad efektid omakorda reguleeritud selle ensüümi N-terminaalse domeeni fosforüleerimise kaudu. Käesolevas töös uuriti selle regulatoorse fosforüleerimise nähtuse tagamaid, kasutades selleks klassikalisi valgukeemia meetodeid ning keemilise kineetika rakendusi koos ligandide seostumise modelleerimisega arvutil. Töö tulemused näitasid, et mitte-fosforüülitud L-PK poolt katalüüsitud reaktsioon on PEP korral iseloomustatud tavalise hüperboolse Michelis-Menteni reaktsioonikiiruse võrrandiga (KPEP = 0.11 mM). Samas lülitas cAMP-sõltuva proteiinkinaasi poolt katalüüsitud valgu fosforüülimine sisse L-PK kooperatiivsuse PEP suhtes ning ka selle ensüümi aktiivsuse allosteerilise regulatsiooni. Nii iseloomustas stöhhiomeetriliselt fosforüleeritud ensüümi, kus ühe valgu tetrameerse molekuli kohta esines neli fosfaatrühma, KPEP väärtus 2.2 mM ja Hilli koefitsient n = 2.5. Samuti ilmnes, et kooperatiivsed omadused lülitusid sisse tetrameerse valgu esimese subühiku fosforüleerimisel, kusjuures edasine fosfaatrühmade lisamine ainult moduleeris seda efekti. Samuti leiti, et mitte-fosforüülitud L-PK aktiivsust ei mõjutanud ka allosteeriline aktivaator FBP. Kuna fosforüleeritud L-PK aktiivsus suureneb oluliselt allosteerilise aktivaatori FBP juuresolekul, siis järeldati, et fosforüleerimine toimib ka selle ensüümi allosteerilise regulatsiooni molekulaarse lülitina. Regulatoorne fosforüülimine toimub seriini nr 12 juures, mis asub N-terminaalses valgujärjestuses MEGPAGYLRR10AS12VAQLTQEL20GTAFF. Selle valgujärjestuse rolli selgitamiseks uuriti fosforüülitava seriini ümbruses asuvate aminohapete punktmutatsioonide mõju valgu katalüütilistele omadustele. Muutused olid positsioonides 9, 10 ja 13 ning asenduseks kasutati aminohappeid A, L, Q ja E, mis võimaldas muuta selle domeeni summaarset laengut ja uurida, kas ioonsete rühmade ümberjaotumine ja uute ioonsete rühmade sisseviimine võib imiteerida seriini jäägi fosforüülimise efekti. Ilmnes, et mõned asendused mõjutasid valgu aktiivsust, vähendades selle afiinsust PEP suhtes ning sellega imiteerisid fosforüülimist. Saadud tulemus on kooskülas A. Fentoni ja kaastöötajate poolt pakutud oletusega (Fenton & Tang, 2009; Holyoak et al., 2013), et N-domeen võib seostuda valgumolekuli mingis muus piirkonnas ja selliselt mõjutada substraadi sidumist. Selle sisemolekulaarse kompleksi lõhub aga domeeni fosforüülimine. Samas aga ilmnes tõsiasi, et N-domeeni struktuuri ja kogulaengu muutmine ei indutseeri ensüümi kooperatiivsust PEP suhtes. Lähtudes oletusest, et N-domeen võib tänu oma paindlikkusele toimida valgumolekuli teiste osadega, teostati arvutil modelleerimise teel võimalike sidumiskohtade otsing. Selleks uuriti regulatoorse domeeni fragmendi RRASVA ja selle fosforüülitud analoogi RRAS(Pi)VA seostumist L-PK alaühikuga. Leiti, et RRASVA seostumine võib toimuda ensüümi aktiivtsentri piirkonnas ning see võib tõepoolest olla oluline PEP sidumise seisukohast. Samal ajal toimus fosfopeptiidi sidumine subühiku C-domeenil, kus seostub allosteeriline ligand FBP. Seega võib sisemolekulaarsete komplekside teke tõepoolest nihutada tasakaalu ensüümi aktiivse R-vormi ja vähemaktiivse T-vormi vahel. Samas võib kooperatiivsuse sisselülitamine toimuda fosforüleeritud N-domeeni seostumisel L-PK allosteerilises tsentris. Molekulaarne lülitusmehhanism allosteerilise ja mitte-allosteerilise L-PK vormide vahel, mis põhineb regulatoorse domeeni fosforüülimisel, võib omada olulist tähtsust maksas toimuva glükoosi metabolism mõistmisel.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
-
- Faustova, Ilona
Subjects
dc:subject × 10Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10062/34065
- OAI identifier oai:identifier
- oai:dspace.ut.ee:10062/34065