The characterisatio n of intestinal lactic acid bacteria using bacteriological, biochemical and molecular approaches

Piimhappebakterid (lactic acid bacteria, LAB), sealhulgas Lactobacillus spp. ja Bifidobacterium spp., kuuluvad inimese kasuliku mikrobioota hulka, säilitades seedekulgla mikroobikoosluste tasakaalu. Samal ajal kutsuvad nad oma rakkude ja ainevahetusproduktidega organismis esile üldefekte, mis võivad mõjustada inimese tervist. Seedekulgla piimhappebakterite liigilist jaotumist ja metaboliite pole erinevatesse eagruppidesse kuuluvatel isikutel, erinevates geograafilistes piirkondades elavatel lastel ning allergilistel ja mitteallergilistel lastel uuritud. Bakterite metaboolset aktiivsust hinnatakse tavaliselt bakterioloogiliste ja biokeemiliste metoodikate abil. Seevastu molekulaarsete uurimismeetoditega saadakse täpsemaid tulemusi. Senini pole aga rakendatud kombineeritud lähenemist, et mõista mikroobide mõju inimese ainevahetusele. Uurimistöö ülesandeks oli iseloomustada bakterioloogiliste, biokeemiliste ja molekulaarsete meetodite abil soolestiku piimhappebakterite liigilist koostist ja metaboolset toimet erineva vanuse, elukoha ja tervisliku seisundiga isikutel. Uurimisalusteks olid 79 Eesti ja 65 Rootsi 1–2 aastast last, 40 last vanuses 5aastat (20 allergilist ja 20 mitteallergilist), 24 tervet täiskasvanut ja 37 eakat isikut. Kokku uuriti 133 laktobatsilli tüve: 35 juhuslikult valitud seedetrakti tüve , 76 Eesti ja Rootsi laste seedetraktist isoleeritud tüve, 21 referentstüve ja üht L. plantarum Inducia DSM 21379 tüve. Isoleeritud laktobatsillide tüved samastati liigi tasemel feno- ja genotüübiliste meetoditega (API 50CHL ja ITS-PCR). Laktobatsillide metaboliite määrati gaaskromatograafiaga: orgaanilisi rasvhappeid (äädik-, piim-, ja merevaikhape) ja etanooli erinevates keskkonnatingimustes ning polü-ja biogeenseid amiine erinevate aminohapete keskkonnas, inimese uriinis ja probiootilises juustus. Inimeste rooja analüüsides määrati laktobatsillide olemasolu PCR meetodiga ja hulk FISH ning real-time PCR meetoditega. Allergiliste ja mitteallergiliste laste bifidobakterite liikide määramiseks kasutati liigi-spetsiifilist PCR-DGGE meetodit koos järgneva kloneerimise ja sekveneerimisega. L. plantarum Inducia DSM 21379 tüve iseloomustati fenotüübilise laktobatsillide API 50CHL samastamiskitiga, molekulaarselt ITS-PCR ja 16S rRNA sekveneerimise ning metaboliite gaaskromatograafiaga. Täiskasvanute ja eakate kehamassi indeks arvutati kehakaalu (kg) ja pikkuse (cm) ruudu suhte alusel. Vereplasma glükoosisisaldus (mmol/L) määrati laboratoorsete standardmeetoditega. Selgus, et erinevates biotehnoloogilistes rakendustes kasutatavate laktobatsillide omaduste kirjeldamiseks sobivad fenotüübilised meetodid, mis põhinevad bakterite ainevahetusel, nagu biokeemilise profiili kindlakstegemine API 50CHL-ga ja metaboliitide määramine gaaskromatograafiaga. Laktobatsillide liikide, eelkõige Lactobacillus acidophilus gruppi kuuluvate bakterite määramiseks on molekulaarsed meetodid nagu ITS-PCR ja 16S rRNA sekveneerimine võrreldes API 50CHLga selgelt eelistatavamad. Bifidobacterium spp. hulga määramiseks imikutel on FISH meetod märkimisväärselt kõrgema tundlikkusega kui bakterioloogiline meetod. Kuid Lactobacillus spp. hulga määramisel nii lastel kui täiskasvanutel ühtib bakterioloogilise ja FISH meetodi kõrge tundlikkus. Erinevates vanuserühmades on laktobatsillide hulgad FISH ja real-time PCR meetoditega määramisel kõrgemad võrreldes bakterioloogiliste meetoditega. Erinevate inimeste soole indigeensete laktobatsillide hulkade ja liikide mitmekesisus on seotud erinevate geograafiliste piirkondadega ja inimese vanusega. Bakterioloogiliselt määratud Lactobacillus spp. kõrgemad hulgad seedekulglas seostuvad täiskasvanutel ja eakatel isikutel kõrgema kehamassi indeksi ja vere glükoosi sisaldusega, kusjuures erinevad laktobatsillide liigid seostuvad erinevalt glükoosi ainevahetusega. Molekulaarsete metoodikatega kinnitusid 5 aastastel lastel eelnevate bakterioloogiliste uuringute tulemused soole bifidobakterite levimuse ja allergia seoste kohta allergilistel ja mitteallergilistel imikutel. Allergilistel lastel prevaleerib seedekulgla bifidobakterite perekonnas B. adolescentis, samas kui mitte-allergilistel lastel on sagedasem B. catenulatum/pseudocatenulatum. Probiootikumina patenteeritud tüvi Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 samastati fenotüpeerimis- (API 50CHL) ja genotüpeerimismeetoditega (ITS-PCR, PFGE), millele lisandus 16S rRNA sekveneerimine. Need uurimismeetodid on heaks võimaluseks laktobatsillide samastamisel ja tüpiseerimisel bioloogilisest materjalist ja probiootilistest toodetest. Putrestsiini märkimisväärne hulk söötmes ja Inducia juustus on vastavuses laktobatsilli tüve Inducia poolse putrestsiini metabolismiga tarbija organismis. Saadud tulemused ja kogutud laktobatsillide tüved pakuvad edaspidiseks võimalusi uute probiootiliste toodete väljatöötamiseks.

Author

• Štšepetova, Jelena

• seedekulgla mikrofloora
• piimhappebakterid
• liigiline koosseis
• ainevahetus
• gastrointestinal microflora
• lactic acid bacteria
• species composition
• metabolism

Identifier

hdl:10062/18170

OAI identifier oai:identifier

oai:dspace.ut.ee:10062/18170