Multiple faces of cell-penetrating peptides – their intracellular trafficking, stability and endosomal escape during protein transduction
Paljude ravimite ja bioaktiivsete ainete (nagu DNA, valgud jms) rakkudesse sisenemine on pärsitud nende ebasobilike mõõtmete, laengu või muude omaduste tõttu, tuues sageli kaasa antud ühendite vähese või puuduliku toime organismis. Selleks, et nende sisenemist soodustada, on võimalik kasutada spetsiaalseid transportivaid molekule, näiteks rakku sisenevaid peptiide (ehk RSP-sid), mis on lühikesed ja enamasti positiivselt laetud valgulised järjestused. RSP-d vahendavad nende külge seotud lastmolekulide sisenemist rakkudesse, tõstes mitmekordselt viimaste rakusisest toimet. Seetõttu omavad nad kõrget potentsiaali ka biomeditsiini valdkonna edasiarendamisel. RSP-lastmolekuli rakkudesse sisenemine toimub eelkõige membraaniga ümbritsetud kandjate ehk endosoomide kaudu, mis punguvad raku sisemusse ja haaravad raku väliskeskkonnast endasse ka RSP koos lastmolekuliga. Sedasorti sisenemine ehk endotsütoos on ühelt poolt küll rakkudele kahjutu, kuid teisalt takistab lastmolekuli sisenemist raku tsütoplasmasse ja/või tuuma, kus tavaliselt paikneb bioaktiivse lastmolekuli sihtmärk. Lisaks sellele suunatakse suur osa endosoomide sisust lagundamisele, mistõttu endosoomidest vabanemine on lastmolekulile tema toime säilimiseks absoluutselt vajalik. Kahjuks on mõistetud, et just endosoomidest vabanemine ning ühendite vähene vastupanuvõime lagundamisele on hetkel ühed olulisemad tagasilöögid RSP-vahendatud transpordis. Seega keskenduski antud töö RSP-valk-komplekside rakusisese suunamise, stabiilsuse ning endosoomidest vabanemise uurimisele. Selgus, et antud kompleksid suunatakse rakkudes järk-järgult happelise keskkonnaga lagundavatesse endosoomidesse. Siiski paikneb vähemalt osa komplekse ka neutraalsema pH-ga endosoomides, kus nad püsivad lagundamata vähemalt kuni 12 tundi pärast sisenemist. Uurides komplekside terviklikkust lähemalt, leidsime, et peptiidi hulga suurendamine kompleksis tagab nii lastmolekuli parema sisenemise kui ka vastupidavuse lagundamisele. Lisaks sellele vallandas peptiidi kontsentratsiooni tõstmine rakkudes valguse kaastoimel endosoomide membraani „katkemise“, mille tagajärjel lekkisid nii peptiid kui lastmolekul raku tsütoplasmasse. Seega avastasime mooduse, mille abil on võimalik tõsta lastmolekuli(de) rakusisese toime efektiivsust. Kuna suur osa kompleksidest suunatakse raku sees siiski lagundamisele, uurisime lagundamise suhtes keemiliselt stabiilsemaks muudetud peptiidide vastupanuvõimet antud protsessile. Vastupidiselt ootustele täheldasime, et teatud peptiidid võivad sellisel kujul olla rakkudele kahjulikud – ühendite tekitatud plasma membraani häiritus ning rakkude energiasünteesi katkemine viis järk-järgulise raku surmani. Seetõttu on ääretult oluline alati kontrollida erinevate muutuste/modifikatsioonide mõju rakkudele. Viimaks uurisime RSP-motiivi sisaldava uudse inhibiitori ARC toimet rakkudes. ARC-i peamine sihtmärkvalk on oluline rakkude kokkutõmbumises, mistõttu antud valgu liigne aktiivsus võib põhjustada näiteks südamehaigusi. Töös esitatud katsetulemused näitasid, et ARC on suuteline edukalt rakkudesse sisenema, seal oma sihtmärgiga seonduma ning takistama temast lähtuvate signaalide levikut. Seega on RSP-sid võimalik tõhusalt ära kasutada ka enamakski kui ainult transpordi vahendajatena.
dissertatsioonid, bioloogia, rakufüsioloogia, bioloogiline transport, peptiidid, cell physiology, peptides
Networked Digital Library of Theses and Dissertations