Implementación de técnicas de secuenciación masiva para el desarrollo de nuevos algoritmos diagnósticos y bioinformáticos en distrófias hereditarias de retina
Las distrofias hereditarias de retina (DHR) son un conjunto de enfermedades degenerativas y, generalmente, progresivas que se caracterizan por la afectación primaria de los fotorreceptores (bastones y conos). Se estima que este grupo de enfermedades afecta, aproximadamente, a 1 de cada 3000 personas (Wright, y cols., 2010) por lo que están englobadas dentro de las denominadas enfermedades raras. Actualmente, las DHR no tienen un tratamiento paliativo ni curativo, y conducen a la pérdida parcial o total de la visión (Rivolta, y cols., 2002). Las DHR se pueden clasificar en base a si afectan predominantemente a los bastones (ej: Retinosis pigmentaria, RP; Coroideremia, CHM; o ceguera nocturna congénita estacionaria, CNCE), a los conos (ej: Distrofia de conos, DC; distrofia de conos y bastones, DCB; alteración en la visión de los colores o acromatopsia, AVC/ACHM; distrofia macular, DM; Retinosquisis, RS; o enfermedad de Stargardt, STGD) o causan la afectación generalizada de ambos tipos de fotorreceptores (ej: Amaurosis congénita de Leber, ACL) (Berger, y cols., 2010; Hamel, 2006). Además, aunque en la mayoría de los casos las DHR se manifiestan con síntomas confinados al ojo, en un 20‐30% de los casos estas enfermedades se encuentran asociadas a otras alteraciones sistémicas (casos sindrómicos). Entre los síndromes más comunes asociados a DHR se encuentran el síndrome de Usher (USH) y el síndrome de Bardet‐Biedl (SBB). Aunque todas estas enfermedades son consideradas entidades clínicas distintas, hay que tener en cuenta que no siempre es fácil distinguirlas ya que presentan una alta heterogeneidad clínica y genética (Estrada‐Cuzcano, y cols., 2012; Neveling, y cols., 2013), lo que complica enormemente su diagnóstico. Las nuevas tecnologías de secuenciación, conocidas como secuenciación masiva o de nueva generación (NGS), han revolucionado el campo de la genética y la genómica, ofreciendo soluciones al abordaje de enfermedades heterogéneas como las DHR, ya que permiten el análisis simultáneo de todos los genes de interés. Actualmente, existen múltiples plataformas diferentes de NGS de distintas compañías comerciales, que difieren en su capacidad, longitud de lecturas, tiempo de protocolo, precio y en el tipo de reacciones químicas que llevan a cabo (Goodwin, y cols., 2016; Liu, y cols., 2012). Entre ellas podemos encontrar: Roche 454 (GS FLX Titanium y GS Junior), Life Technologies (ej: SOLiD 5500xl, Ion Torrent PGM) e Illumina (ej: HiSeq, MiSeq, NextSeq). El objetivo de la presente tesis doctoral es diseñar, validar e implementar una aproximación para el diagnóstico de las DHR basada en paneles de genes específicos de nuestra población y un sistema personalizado de los datos generados por NGS. Con esta estrategia se pretende conseguir una tasa diagnóstica elevada que sea similar o superior a la resultante de estudios que incluyen un mayor número de genes, para poder comprobar así su costo‐eficiencia. Además, permitirían determinar el número de casos que necesitan que su diagnóstico sea rectificado debido al solapamiento clínico de las distintas patologías, así como esclarecer el efecto de mutaciones de dudosa patogenicidad. Por otro lado, estos paneles permiten seleccionar los casos candidatos a portar mutaciones en genes no previamente asociados con las DHR, que posteriormente serán analizados por secuenciación del exoma completo (WES) para la identificación de los mismos. En el presente trabajo se han secuenciado por NGS un total de 159 pacientes afectos de DHRs, de los cuales 20 tenían un diagnóstico molecular previo y fueron utilizados como controles positivos para evaluar la fiabilidad de las estrategias llevadas a cabo. Todas las variantes patogénicas presentes en estas muestras utilizadas para la validación del sistema fueron identificadas tras el análisis de los datos, obteniendo así una tasa de detección de mutaciones del 100%. De las 139 familias restantes que no contaban con un diagnóstico genético con anterioridad a este estudio, se consiguió diagnosticar a 94 de ellas, dando una tasa diagnóstica del 67,62%. Este porcentaje es similar e incluso superior al obtenido en otros estudios donde el número de genes analizado era más elevado (Wang, y cols., 2013), confirmando así la eficiencia de los paneles de genes específicos de población. Además, los datos generados por NGS llevaron a la rectificación del diagnóstico clínico de 26 de las 94 familias resueltas (27.66%), lo que se explica por el solapamiento fenotípico de este grupo de enfermedades. Es importante tener en cuenta que la mayoría de estos casos reclasificados no hubieran sido diagnosticados mediante aproximaciones dependientes del diagnóstico clínico previo, como pueden ser los paneles de genes diseñados para un único fenotipo. De ser así, la tasa diagnóstica en este estudio hubiera sido significativamente inferior pasando de un 67,62% a menos de un 50%. Por este motivo, esta visión podría considerarse obsoleta y se demuestra que el abordaje más eficiente para enfermedades heterogéneas es el uso de estrategias libres de hipótesis prefijadas. Del mismo modo, contar con este tipo de estrategias puede facilitar la identificación de nuevas correlaciones genotipo‐fenotipo y ampliar el espectro fenotípico de genes ya asociados con la enfermedad. Los diversos estudios presentados en este trabajo han permitido determinar la prevalencia de los genes mutados en nuestra población. Se detectaron mutaciones patogénicas en 37 de los genes analizados, siendo el gen USH2A el más frecuentemente mutado en nuestra población y la principal causa de RPAR, seguido de los genes CRB1, EYS y RP1. Por otro lado, los genes RHO y PRPF31 fueron los más prevalentes en RPAD y, del mismo modo, RPGR fue la causa más frecuente de RPLX. Respecto a otras DHR, el gen CEP290 fue el que mostró una mayor prevalencia en ACL, ABCA4 fue considerado causal en la mayoría de los casos con STGD, BBS1 fue el más frecuente en el SBB y los genes USH2A, MYO7A y CDH3 fueron los más mutados en el síndrome de Usher (Millan, y cols., 2011). Además, los resultados aquí presentados hanpermitido identificar un total de 51 mutaciones nuevas nunca antes asociadas a enfermedad y han llevado a cuestionar la patogenicidad de dos variantes previamente consideradas como patogénicas (p.Cys759Phe de USH2A y c.206G>A de CA4). A pesar de que la secuenciación de paneles de genes ha resultado ser una buena herramienta para fines diagnósticos, el estudio de los casos que no han sido resueltos por esta aproximación requiere de otras estrategias que impliquen a un mayor número de regiones génicas. Por este motivo, se llevó a cabo la WES de una familia previamente analizada, sin resultados positivos, por nuestro panel. Esta secuenciación permitió identificar dos variantes que cosegregaban con la enfermedad (RPAR) en un gen no asociado previamente a DHR. Este resultado nos llevó a incluir este gen en la siguiente actualización de nuestro panel, lo que hizo que pudiéramos encontrar una segunda familia no relacionada con mutaciones en el mismo gen. Estos resultados, unidos a diversos estudios funcionales realizados tanto en la presente tesis doctoral como por otros autores, nos llevó a considerar este gen como un nuevo candidato de RPAR en humanos y, por tanto, considerar resueltas estas dos familias. Por tanto, tener un control total de las regiones diana de nuestro panel de genes nos ha permitido conocer las ventajas y limitaciones de nuestro diseño, así como hallar por nosotros mismos la solución a los problemas que nos hemos ido encontrando en la práctica y postular posibles mejoras para nuestro sistema. Además, al tratarse de un diseño personalizado hemos tenido la oportunidad de ir realizando diversas actualizaciones, basadas en los resultados obtenidos, que han ido mejorando progresivamente nuestro diseño. Del mismo modo, desarrollar un algoritmo bioinformático ajustado a las características y necesidades de nuestro proyecto nos ha permitido disponer de un sistema de análisis productivo que proporciona un control absoluto sobre la naturaleza de los datos generados por NGS y, por tanto, de la calidad del proceso, lo que es sumamente prioritario para la práctica clínica por razones médico‐legales (Gullapalli, y cols., 2012a; Gullapalli, y cols., 2012b). La decisión de utilizar un sistema de análisis personalizado, basado en la combinación de paquetes de programas disponibles públicamente, en lugar de un sistema de análisis comercial, ha tenido un efecto favorable sobre la efectividad del proceso y nos ha facilitado la interpretación de los datos.
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