{"id":{"repo_id":"qucosa-diss","oai_identifier":"oai:qucosa:de:qucosa:74244"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/qucosa-diss/oai:qucosa:de:qucosa:74244","repository":{"repo_id":"qucosa-diss","name":"QUCOSA","base_url":"http://www.qucosa.de/oai/"},"display":{"title":"Quantifizierung und zelluläre Lokalisation von Eisen in der Substantia nigra bei Patienten mit Parkinsonscher Erkrankung und gesunden Kontrollen","abstract":"Zusammenfassung der Arbeit Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Titel: Quantifizierung und zelluläre Lokalisation von Eisen in der Substantia nigra bei Patienten mit Parkinsonscher Erkrankung und gesunden Kontrollen eingereicht von Isabel Weigelt angefertigt an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig Paul Flechsig Institut für Hirnforschung, Abteilung Molekulare und Zelluläre Mechanismen der Neurodegeneration betreut von PD Dr. Dr. Markus Morawski Prof. Dr. Thomas Arendt November 2019 Das Spurenelement Eisen ist aufgrund seiner Schlüsselrolle in der Neurotransmittersynthese oder der Myelinisierung essentiell für Neuronen. Sein ubiquitäres Vorkommen erfordert eine Regulierung der Eisenhomöostase in engen Grenzen. Hohe Konzentrationen an freiem Eisen sind jedoch in der Lage, über den Weg der Fenton-Reaktion das oxidative Stresslevel der Zelle drastisch zu erhöhen und die Bildung vermehrter reaktiver Sauerstoffspezies zu triggern; betroffene Zellen degenerieren. Eine Erhöhung der Eisenkonzentration wird bei zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben, so auch bei Parkinsonscher Erkrankung (PD). Die aktuelle Datenlage zu quantitativen Eisenkonzentrationen in den verschiedenen Zelltypen innerhalb der menschlichen SN ist jedoch rar. Elementanalysen, vor allem von Eisen, bieten eine ideale Möglichkeit, um die Rolle des Eisens sowie der Eisenspeicherformen im Rahmen der Pathogenesemechanismen weiter zu entschlüsseln und so besser beurteilen zu können. Ziel der Arbeit war es, neben der Beschreibung typischer Veränderungen der Zellen bei PD die Verteilung der Haupteisenspeicherformen Ferritin und Neuromelanin darzustellen sowie eine eventuelle Kolokalisation mit Gliazellarten aufzudecken. Quantitativ sollte eine Bestimmung des Gesamteiseins und der differentiellen ortsaufgelösten zellulären Eisenkonzentration erfolgen, um direkte Veränderungen in den Eisenkonzentrationen zwischen Kontrollen und PD identifizieren zu können. Hierfür erfolgte zu qualitativen Analysezwecken zunächst eine klassische sowie Fluoreszenz-immunhistochemische Darstellung zellspezifischer Marker (anti-HuC/D, -IBA-1, -GFAP, -CNPase, -OLig2, -MBP, -Ferritin, -HLA) nach Standardprotokoll mit einer Ni-DAB Verstärkung. Histochemische Färbungen nach Perls und Turnbull wurden zum semiquantitativen Eisennachweis durchgeführt. Als Methode zur ortsaufgelösten quantitativen Eisenbestimmung kam die Ionenstrahlmikroskopie (Partikel-induzierte Röntgen-Emission, PIXE) zur Anwendung. Die wichtigsten Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt: Immunhistochemie und Histochemie • Typische zelluläre Veränderungen bei PD konnten in Übereinstimmung mit bestehender Literatur immunhistochemisch bestätigt werden. So findet sich der höchste Neuronenverlust im Nigrosom 1, die Gliazellen zeigen deutliche Aktivierungszeichen hinsichtlich ihrer Verteilung und Morphologie. • Eine Kolokalisation von Ferritin mit Oligodendrozyten konnte sowohl über klassische Immunhistochemie als auch über eine Fluoreszenz-Doppelmarkierung gezeigt werden. • Bei PD nimmt die Dichte von Ferritin-positiven Oligodendrozyten zu. • Als Zeichen für eine Aktivierung der Oligodendrozyten bei PD sind die erhöhte Oigodendrozytendichte und degenerative Veränderungen der Myelinfasern in Kombination mit einer erhöhten MBP-Immunreaktivität denkbar. • Bei PD sind semiquantitativ höhere Bestände nicht-chelatierten Fe3+ nachweisbar, das flächenmäßig dargestellte eisenreiche Gebiet der SN zeigt in > 50% der Fälle mit PD eine größere Ausdehnung (Färbung nach Perls). Das Nigrosom 1 ist bei PD nicht mehr anhand einer schwächeren Farbreaktion im Vergleich zur gesamten SN auszumachen. Ionenstrahlmikroskopie • Mit dem Ionenstrahlmikroskop wurden erstmals selektiv gefärbte Zellarten in der humanen SN bei PD und Kontrollen hinsichtlich ihrer zellulären Eisenkonzentration vergleichend quantifiziert. • Das Gesamteisen im Nigrosom 1 beträgt bei den Kontrollen ca. 2,49 mmol/l, bei PD ca. 3,00 mmol/l. • Neuronen zeigen bei PD eine um ca. 107 % erhöhte Eisenkonzentration (KO: 1,98 mmol/l). • Mikrogliazellen vergrößern im Rahmen ihrer Aktivierung bei PD ihre zellulären Eisenbestände um ca. 26 % (KO: 3,19 mmol/l). • Die zelluläre Eisenkonzentration der Astrozyten ist bei PD nicht signifikant verändert (KO: 4,31 mmol/l; PD: 4,11 mmol/l). • Oligodendroglia weisen in Abhängigkeit des verwendeten Zellmarkers unterschiedliche zelluläre Eisenkonzentrationen auf. Olig2-positive Zellen akkumulieren bei PD im Durchschnitt 250% mehr Eisen (KO: 2,76 mmol/l), CNPase-positive Oligodendrozyten ca. 64 % mehr Eisen (KO: 1,81). • Neuromelanin ist bei PD infolge der Neurodegeneration zunehmend extrazellulär zu finden und deutlich stärker mit Eisen beladen (KO: 8,73 mmol/l; PD: 14,21 mmol/l). • Ferritin-positive Oligodendrozyten besitzen unter den Gliazellen den höchsten zellulären Eisengehalt (6,01 mmol/l). Bei PD sinkt die zelluläre Eisenkonzentration jedoch auf ca. 51 %, was eine Entleerung der Ferritinspeicher mutmaßen lässt. Eine Erhöhung der Eisenkonzentration ist in nahezu allen untersuchten Zellarten zu beobachten. Eine vermutete Entleerung der Ferritinspeicher impliziert in Kombination mit der steigenden zellulären Eisenkombination letztlich eine Vergrößerung des LIP der Zellen in der SN bei PD. Diese Hypothese wird durch die bei PD entschieden intensiver ausfallende Perls-Färbung zum Nachweis nicht-chelatierten Fe3+ gestützt. Eisen kommt unumstritten eine nicht zu vernachlässigende Rolle bei neurodegenerativen Prozessen zu. Die Quantifizierung von Eisen in verschiedenen Zelltypen gibt Aufschluss über die Veränderung der Eisenkonzentrationen bei PD. Dennoch bleiben genaue Mechanismen, die zu einem Anstieg des Eisens führen, Gegenstand weiterer Forschungen.","abstract_html":"Zusammenfassung der Arbeit Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. 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Eine Erhöhung der Eisenkonzentration wird bei zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben, so auch bei Parkinsonscher Erkrankung (PD). Die aktuelle Datenlage zu quantitativen Eisenkonzentrationen in den verschiedenen Zelltypen innerhalb der menschlichen SN ist jedoch rar. Elementanalysen, vor allem von Eisen, bieten eine ideale Möglichkeit, um die Rolle des Eisens sowie der Eisenspeicherformen im Rahmen der Pathogenesemechanismen weiter zu entschlüsseln und so besser beurteilen zu können. Ziel der Arbeit war es, neben der Beschreibung typischer Veränderungen der Zellen bei PD die Verteilung der Haupteisenspeicherformen Ferritin und Neuromelanin darzustellen sowie eine eventuelle Kolokalisation mit Gliazellarten aufzudecken. Quantitativ sollte eine Bestimmung des Gesamteiseins und der differentiellen ortsaufgelösten zellulären Eisenkonzentration erfolgen, um direkte Veränderungen in den Eisenkonzentrationen zwischen Kontrollen und PD identifizieren zu können. 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So findet sich der höchste Neuronenverlust im Nigrosom 1, die Gliazellen zeigen deutliche Aktivierungszeichen hinsichtlich ihrer Verteilung und Morphologie. • Eine Kolokalisation von Ferritin mit Oligodendrozyten konnte sowohl über klassische Immunhistochemie als auch über eine Fluoreszenz-Doppelmarkierung gezeigt werden. • Bei PD nimmt die Dichte von Ferritin-positiven Oligodendrozyten zu. • Als Zeichen für eine Aktivierung der Oligodendrozyten bei PD sind die erhöhte Oigodendrozytendichte und degenerative Veränderungen der Myelinfasern in Kombination mit einer erhöhten MBP-Immunreaktivität denkbar. • Bei PD sind semiquantitativ höhere Bestände nicht-chelatierten Fe3+ nachweisbar, das flächenmäßig dargestellte eisenreiche Gebiet der SN zeigt in > 50% der Fälle mit PD eine größere Ausdehnung (Färbung nach Perls). Das Nigrosom 1 ist bei PD nicht mehr anhand einer schwächeren Farbreaktion im Vergleich zur gesamten SN auszumachen. Ionenstrahlmikroskopie • Mit dem Ionenstrahlmikroskop wurden erstmals selektiv gefärbte Zellarten in der humanen SN bei PD und Kontrollen hinsichtlich ihrer zellulären Eisenkonzentration vergleichend quantifiziert. • Das Gesamteisen im Nigrosom 1 beträgt bei den Kontrollen ca. 2,49 mmol/l, bei PD ca. 3,00 mmol/l. • Neuronen zeigen bei PD eine um ca. 107 % erhöhte Eisenkonzentration (KO: 1,98 mmol/l). • Mikrogliazellen vergrößern im Rahmen ihrer Aktivierung bei PD ihre zellulären Eisenbestände um ca. 26 % (KO: 3,19 mmol/l). • Die zelluläre Eisenkonzentration der Astrozyten ist bei PD nicht signifikant verändert (KO: 4,31 mmol/l; PD: 4,11 mmol/l). • Oligodendroglia weisen in Abhängigkeit des verwendeten Zellmarkers unterschiedliche zelluläre Eisenkonzentrationen auf. Olig2-positive Zellen akkumulieren bei PD im Durchschnitt 250% mehr Eisen (KO: 2,76 mmol/l), CNPase-positive Oligodendrozyten ca. 64 % mehr Eisen (KO: 1,81). • Neuromelanin ist bei PD infolge der Neurodegeneration zunehmend extrazellulär zu finden und deutlich stärker mit Eisen beladen (KO: 8,73 mmol/l; PD: 14,21 mmol/l). • Ferritin-positive Oligodendrozyten besitzen unter den Gliazellen den höchsten zellulären Eisengehalt (6,01 mmol/l). Bei PD sinkt die zelluläre Eisenkonzentration jedoch auf ca. 51 %, was eine Entleerung der Ferritinspeicher mutmaßen lässt. Eine Erhöhung der Eisenkonzentration ist in nahezu allen untersuchten Zellarten zu beobachten. Eine vermutete Entleerung der Ferritinspeicher impliziert in Kombination mit der steigenden zellulären Eisenkombination letztlich eine Vergrößerung des LIP der Zellen in der SN bei PD. Diese Hypothese wird durch die bei PD entschieden intensiver ausfallende Perls-Färbung zum Nachweis nicht-chelatierten Fe3+ gestützt. 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Eine Erhöhung der Eisenkonzentration wird bei zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben, so auch bei Parkinsonscher Erkrankung (PD). Die aktuelle Datenlage zu quantitativen Eisenkonzentrationen in den verschiedenen Zelltypen innerhalb der menschlichen SN ist jedoch rar. Elementanalysen, vor allem von Eisen, bieten eine ideale Möglichkeit, um die Rolle des Eisens sowie der Eisenspeicherformen im Rahmen der Pathogenesemechanismen weiter zu entschlüsseln und so besser beurteilen zu können. Ziel der Arbeit war es, neben der Beschreibung typischer Veränderungen der Zellen bei PD die Verteilung der Haupteisenspeicherformen Ferritin und Neuromelanin darzustellen sowie eine eventuelle Kolokalisation mit Gliazellarten aufzudecken. Quantitativ sollte eine Bestimmung des Gesamteiseins und der differentiellen ortsaufgelösten zellulären Eisenkonzentration erfolgen, um direkte Veränderungen in den Eisenkonzentrationen zwischen Kontrollen und PD identifizieren zu können. Hierfür erfolgte zu qualitativen Analysezwecken zunächst eine klassische sowie Fluoreszenz-immunhistochemische Darstellung zellspezifischer Marker (anti-HuC/D, -IBA-1, -GFAP, -CNPase, -OLig2, -MBP, -Ferritin, -HLA) nach Standardprotokoll mit einer Ni-DAB Verstärkung. Histochemische Färbungen nach Perls und Turnbull wurden zum semiquantitativen Eisennachweis durchgeführt. Als Methode zur ortsaufgelösten quantitativen Eisenbestimmung kam die Ionenstrahlmikroskopie (Partikel-induzierte Röntgen-Emission, PIXE) zur Anwendung. Die wichtigsten Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt: Immunhistochemie und Histochemie • Typische zelluläre Veränderungen bei PD konnten in Übereinstimmung mit bestehender Literatur immunhistochemisch bestätigt werden. So findet sich der höchste Neuronenverlust im Nigrosom 1, die Gliazellen zeigen deutliche Aktivierungszeichen hinsichtlich ihrer Verteilung und Morphologie. • Eine Kolokalisation von Ferritin mit Oligodendrozyten konnte sowohl über klassische Immunhistochemie als auch über eine Fluoreszenz-Doppelmarkierung gezeigt werden. • Bei PD nimmt die Dichte von Ferritin-positiven Oligodendrozyten zu. • Als Zeichen für eine Aktivierung der Oligodendrozyten bei PD sind die erhöhte Oigodendrozytendichte und degenerative Veränderungen der Myelinfasern in Kombination mit einer erhöhten MBP-Immunreaktivität denkbar. • Bei PD sind semiquantitativ höhere Bestände nicht-chelatierten Fe3+ nachweisbar, das flächenmäßig dargestellte eisenreiche Gebiet der SN zeigt in > 50% der Fälle mit PD eine größere Ausdehnung (Färbung nach Perls). Das Nigrosom 1 ist bei PD nicht mehr anhand einer schwächeren Farbreaktion im Vergleich zur gesamten SN auszumachen. Ionenstrahlmikroskopie • Mit dem Ionenstrahlmikroskop wurden erstmals selektiv gefärbte Zellarten in der humanen SN bei PD und Kontrollen hinsichtlich ihrer zellulären Eisenkonzentration vergleichend quantifiziert. • Das Gesamteisen im Nigrosom 1 beträgt bei den Kontrollen ca. 2,49 mmol/l, bei PD ca. 3,00 mmol/l. • Neuronen zeigen bei PD eine um ca. 107 % erhöhte Eisenkonzentration (KO: 1,98 mmol/l). • Mikrogliazellen vergrößern im Rahmen ihrer Aktivierung bei PD ihre zellulären Eisenbestände um ca. 26 % (KO: 3,19 mmol/l). • Die zelluläre Eisenkonzentration der Astrozyten ist bei PD nicht signifikant verändert (KO: 4,31 mmol/l; PD: 4,11 mmol/l). • Oligodendroglia weisen in Abhängigkeit des verwendeten Zellmarkers unterschiedliche zelluläre Eisenkonzentrationen auf. Olig2-positive Zellen akkumulieren bei PD im Durchschnitt 250% mehr Eisen (KO: 2,76 mmol/l), CNPase-positive Oligodendrozyten ca. 64 % mehr Eisen (KO: 1,81). • Neuromelanin ist bei PD infolge der Neurodegeneration zunehmend extrazellulär zu finden und deutlich stärker mit Eisen beladen (KO: 8,73 mmol/l; PD: 14,21 mmol/l). • Ferritin-positive Oligodendrozyten besitzen unter den Gliazellen den höchsten zellulären Eisengehalt (6,01 mmol/l). Bei PD sinkt die zelluläre Eisenkonzentration jedoch auf ca. 51 %, was eine Entleerung der Ferritinspeicher mutmaßen lässt. Eine Erhöhung der Eisenkonzentration ist in nahezu allen untersuchten Zellarten zu beobachten. Eine vermutete Entleerung der Ferritinspeicher impliziert in Kombination mit der steigenden zellulären Eisenkombination letztlich eine Vergrößerung des LIP der Zellen in der SN bei PD. Diese Hypothese wird durch die bei PD entschieden intensiver ausfallende Perls-Färbung zum Nachweis nicht-chelatierten Fe3+ gestützt. 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Eine Erhöhung der Eisenkonzentration wird bei zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben, so auch bei Parkinsonscher Erkrankung (PD). Die aktuelle Datenlage zu quantitativen Eisenkonzentrationen in den verschiedenen Zelltypen innerhalb der menschlichen SN ist jedoch rar. Elementanalysen, vor allem von Eisen, bieten eine ideale Möglichkeit, um die Rolle des Eisens sowie der Eisenspeicherformen im Rahmen der Pathogenesemechanismen weiter zu entschlüsseln und so besser beurteilen zu können. Ziel der Arbeit war es, neben der Beschreibung typischer Veränderungen der Zellen bei PD die Verteilung der Haupteisenspeicherformen Ferritin und Neuromelanin darzustellen sowie eine eventuelle Kolokalisation mit Gliazellarten aufzudecken. Quantitativ sollte eine Bestimmung des Gesamteiseins und der differentiellen ortsaufgelösten zellulären Eisenkonzentration erfolgen, um direkte Veränderungen in den Eisenkonzentrationen zwischen Kontrollen und PD identifizieren zu können. Hierfür erfolgte zu qualitativen Analysezwecken zunächst eine klassische sowie Fluoreszenz-immunhistochemische Darstellung zellspezifischer Marker (anti-HuC/D, -IBA-1, -GFAP, -CNPase, -OLig2, -MBP, -Ferritin, -HLA) nach Standardprotokoll mit einer Ni-DAB Verstärkung. Histochemische Färbungen nach Perls und Turnbull wurden zum semiquantitativen Eisennachweis durchgeführt. Als Methode zur ortsaufgelösten quantitativen Eisenbestimmung kam die Ionenstrahlmikroskopie (Partikel-induzierte Röntgen-Emission, PIXE) zur Anwendung. Die wichtigsten Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt: Immunhistochemie und Histochemie • Typische zelluläre Veränderungen bei PD konnten in Übereinstimmung mit bestehender Literatur immunhistochemisch bestätigt werden. So findet sich der höchste Neuronenverlust im Nigrosom 1, die Gliazellen zeigen deutliche Aktivierungszeichen hinsichtlich ihrer Verteilung und Morphologie. • Eine Kolokalisation von Ferritin mit Oligodendrozyten konnte sowohl über klassische Immunhistochemie als auch über eine Fluoreszenz-Doppelmarkierung gezeigt werden. • Bei PD nimmt die Dichte von Ferritin-positiven Oligodendrozyten zu. • Als Zeichen für eine Aktivierung der Oligodendrozyten bei PD sind die erhöhte Oigodendrozytendichte und degenerative Veränderungen der Myelinfasern in Kombination mit einer erhöhten MBP-Immunreaktivität denkbar. • Bei PD sind semiquantitativ höhere Bestände nicht-chelatierten Fe3+ nachweisbar, das flächenmäßig dargestellte eisenreiche Gebiet der SN zeigt in > 50% der Fälle mit PD eine größere Ausdehnung (Färbung nach Perls). Das Nigrosom 1 ist bei PD nicht mehr anhand einer schwächeren Farbreaktion im Vergleich zur gesamten SN auszumachen. Ionenstrahlmikroskopie • Mit dem Ionenstrahlmikroskop wurden erstmals selektiv gefärbte Zellarten in der humanen SN bei PD und Kontrollen hinsichtlich ihrer zellulären Eisenkonzentration vergleichend quantifiziert. • Das Gesamteisen im Nigrosom 1 beträgt bei den Kontrollen ca. 2,49 mmol/l, bei PD ca. 3,00 mmol/l. • Neuronen zeigen bei PD eine um ca. 107 % erhöhte Eisenkonzentration (KO: 1,98 mmol/l). • Mikrogliazellen vergrößern im Rahmen ihrer Aktivierung bei PD ihre zellulären Eisenbestände um ca. 26 % (KO: 3,19 mmol/l). • Die zelluläre Eisenkonzentration der Astrozyten ist bei PD nicht signifikant verändert (KO: 4,31 mmol/l; PD: 4,11 mmol/l). • Oligodendroglia weisen in Abhängigkeit des verwendeten Zellmarkers unterschiedliche zelluläre Eisenkonzentrationen auf. Olig2-positive Zellen akkumulieren bei PD im Durchschnitt 250% mehr Eisen (KO: 2,76 mmol/l), CNPase-positive Oligodendrozyten ca. 64 % mehr Eisen (KO: 1,81). • Neuromelanin ist bei PD infolge der Neurodegeneration zunehmend extrazellulär zu finden und deutlich stärker mit Eisen beladen (KO: 8,73 mmol/l; PD: 14,21 mmol/l). • Ferritin-positive Oligodendrozyten besitzen unter den Gliazellen den höchsten zellulären Eisengehalt (6,01 mmol/l). Bei PD sinkt die zelluläre Eisenkonzentration jedoch auf ca. 51 %, was eine Entleerung der Ferritinspeicher mutmaßen lässt. Eine Erhöhung der Eisenkonzentration ist in nahezu allen untersuchten Zellarten zu beobachten. Eine vermutete Entleerung der Ferritinspeicher impliziert in Kombination mit der steigenden zellulären Eisenkombination letztlich eine Vergrößerung des LIP der Zellen in der SN bei PD. Diese Hypothese wird durch die bei PD entschieden intensiver ausfallende Perls-Färbung zum Nachweis nicht-chelatierten Fe3+ gestützt. 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