Analysis and functional characterization in embryonic mouse neocortex of a set of human-specific genes expressed in neural progenitor cells of fetal human neocortex

Einführung: Eine entscheidende Ursache für das Aufkommen der den modernen Menschen charakterisierenden kognitiven Funktionen ist in der beachtlichen Vergrößerung des menschlichen Neocortex innerhalb der letzten 5-7 Millionen Jahre zu finden. Die Identifizierung der dieser Entwicklung zu Grunde liegenden genomischen Veränderungen ist letztlich nicht nur bedeutsam für die Beantwortung der Frage, welche evolutionären Anpassungen den Menschen kennzeichnen, sondern auch für ein besseres Verständnis einer möglicherweise besonderen Anfälligkeit gegenüber neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen. Kürzlich konnten 15 menschenspezifische Gene, deren Expression sich vorzugsweise in neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) des menschlichen fetalen Neokortexes nachweisen lässt, identifiziert werden (Florio et al., 2018). Drei davon (FAM72B, C und D) sind vor 3,4 – 1 Millionen Jahren im menschlichen Genom durch Genduplikationen entstanden und gehören zur Family of sequence similarity 72 (FAM72). Zielsetzung und Ansätze: Konkret wurde betrachtet, ob FAM72D durch die spezifischen Substitutionen von Aminosäuren eine sich von der Funktion des anzestralen Gens FAM72A unterscheidende Rolle in der neokortikalen Entwicklung einnimmt. Untersucht wurden deshalb die Effekte von FAM72A und D auf die Proliferationskapazität und Genexpression von NPCs nach der ektopen Expression von FAM72A oder D während der embryonalen Entwicklung des Neocortex der Maus. Methoden: Die in utero Elektroporation (IUE) embryonaler Mäusegehirne erfolgte zur Expression eines rot oder grün fluoreszierenden Proteins (RFP oder GFP) entweder gemeinsam mit einem leeren DNA pCAGGS Vektor als Kontrollbedingung oder aber einem pCAGGS-FAM72A oder pCAGGS-FAM72D Plasmid. Die in der zweiten Ergebnissektion (Results II) präsentierten IUE wurden dabei im dorsolateralen Neokortex zum Höhepunkt der Neurogenese am 14. Entwicklungstag (E 14.5) durchgeführt, im Unterschied zu den Experimenten in der dritten Sektion (Results III), die im medialen Neokortex am 18. Entwicklungstag (E 18.5) während der Spätphase der embryonalen Neurogenese realisiert wurden. Die Proliferation der NPCs wurde durch Immunfluoreszenzanalysen zweier Marker (Ki67 und phosphoryliertes Histon 3) bestimmt. Zudem wurde die Häufigkeit wichtiger Subtypen von NPCs ebenfalls durch Immunfluoreszenzanalysen eines Markers für basale intermediäre Vorläuferzellen (bIPs → Tbr2) sowie für basale und apikale radiale Gliazellen (aRGs, bRGs → Sox2) ermittelt. Die Gliogenese wurde durch Olig2 Immunfluoreszenz quantifiziert. Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die Fähigkeit der NPCs, den Zellzyklus nach der IUE von FAM72D erneut einzuleiten, zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde schwangeren Mäusen 24 h nach der IUE das Thymidin-Analogon 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) intraperitoneal injiziert. Damit wurden alle Zellen markiert, die sich zu diesem Zeitpunkt in der S-Phase des Zellzyklus befanden und damit den Zellzyklus nach der IUE fortsetzten. Nach weiteren 24 h (48 h post-IUE) erfolgte die Auswertung: alle Ki67- und EdU-doppelt positiven Zellen wurden als solche betrachtet, die den Zellzyklus nach IUE fortführten (EdU+) und nach weiteren 24 h noch immer proliferierten (Ki67+). Zur Durchführung der Transkriptomanalyse wurden Mäuse am 13. Entwicklungstag mit pCAGGS-GFP und entweder dem leeren DNA-Vektor (pCAGGS, Kontrolle) oder einem die Expression von FAM72A (pCAGGS-FAM72A) oder FAM72D (pCAGGS-FAM72D) ermöglichenden Vektor elektroporiert. Anschließend wurden die elektroporierten dorsolateralen neokortikalen Bereiche am 14. Entwicklungstag mikroskopisch seziert und in einzelne Zellen dissoziiert. Die Isolation der elektroporierten (GFP+) Zellen erfolgte aus den Einzelzellsuspensionen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Im Anschluss wurden die isolierten Zellen für die RNA-Sequenzierung vorbereitet. Die primäre Datenanalyse der Ergebnisse der RNA-Sequenzierung wurde entsprechend etablierter Protokolle durchgeführt (Florio et al., 2015). Ergebnisse: Die Analyse der Immunfluoreszenzquanitfizierungen (Results II und III) ergab keine signifikanten Veränderungen der proliferativen Parameter oder der Häufigkeit der NPCs in der ventrikulären Zone (VZ) oder subventrikulären Zone (SVZ) des sich entwickelnden Mausneokortex nach der ektopen Expression von FAM72A oder FAM72D im Vergleich zur Kontrollbedingung. Die Transkriptomanalyse (Results IV) zeigte jedoch 88 signifikant hoch- und 52 herunterregulierte Gene in Folge der FAM72A sowie 91 signifikant hoch- und 67 herunterregulierte Gene nach der FAM72D Expression im Vergleich zur Kontrolle. Es wurde festgestellt, dass nur zwei dieser differentiell exprimierten Gene in Folge der ektopen Expression sowohl von FAM72A als auch FAM72D hochreguliert wurden und ein Expressionslevel > 1 fpkm aufwiesen: Syde1 und Shisa5. Darüber hinaus wurden sechs Gene mit > 1 fpkm identifiziert, die spezifisch nach der Expression von FAM72D hochreguliert waren: Tapbp, Mtfp1, Slitrk5, Parp9, Cnp, Rbm43. Darüber hinaus zeigte die Genontologie-Analyse (Gen Ontology) eine signifikante Anreicherung von Angiogenese-assoziierten Genen (z. B. Vegfc) im Datensatz der artifiziell FAM72A exprimierenden Zellen. Interessanterweise konnte beobachtet werden, dass unter den im Vergleich zur Kontrolle differentiell exprimierten Genen mehr Gene mit typischer Expression in NPCs in Folge von FAM72D als FAM72A Expression hochreguliert und mehr NPC typische Gene nach FAM72A Expression herunterreguliert wurden. Im Falle der Gene, deren Expression eher in Neuronen zu finden ist, zeigte sich ein entgegengesetztes Bild (Results IV). Diese Befunde lassen den vorsichtigen Schluss zu, dass FAM72D stärker als FAM72A die Aufrechterhaltung von NPC-Eigenschaften positiv beeinflussen kann. Schlussfolgerungen: In einer früheren Studie erhöhte der Knockdown von Fam72a in NPCs erwachsener Mäuse die Neurogenese (Benayoun et al., 2014). Dies legt in Verbindung mit den vorliegenden Ergebnissen nahe, dass FAM72A und FAM72D nicht hinreichend, möglicherweise jedoch notwendig sind, um die Aufrechterhaltung des Vorläuferzellcharakters von NPCs zu fördern (Results II, III). Aus diesem Grund sollte das in dieser Studie verfolgte Gain of Function Design durch einen Loss of Function Ansatz ergänzt werden. Als Modellsystem bieten sich hierfür insbesondere Hirnorganoide aus Stammzellen des Schimpansen oder Menschen an. Da alle der kürzlich identifizierten menschenspezifischen Gene in den gleichen NPCs exprimiert werden, sollte auch die potenzielle synergistische Wirkung auf die NPC-Proliferation der FAM72 und der zwölf anderen humanspezifischen Gene wie etwa ARHGAP11B analysiert werden. Neben anderen möglichen Mechanismen, die auf Grundlage der Genexpressionsanalyse im Diskussionsteil dieser Arbeit (Results IV und Discussion) erörtert wurden, könnte die Hochregulierung von Slitrk5 in Folge der ektopen Expression des humanspezifischen FAM72D besonders relevant sein. Es ist bekannt, dass Slitrk5 am Recycling des TrKB-Rezeptors beteiligt ist (Song et al., 2015), der wiederum grundlegende Aspekte der Gehirnentwicklung beeinflusst. Ebenfalls konnte bereits gezeigt werden, dass FAM72A die Funktion des TrKB Rezeptors hemmt (Nehar et al., 2009). Somit ist denkbar, dass FAM72D im menschlichen Neokortex die Wiederherstellung der TrKB-Rezeptorfunktion indirekt über Slitrk5 verbessert und dadurch wesentliche Parameter wie das Überleben von Vorläuferzellen und die Neurogenese beim Menschen verlängern oder verstärken könnte. Diese Studie stellt damit die erste funktionelle Charakterisierung der evolutionär hochinteressanten, die FAM72 Gene beinhaltende Region des menschlichen Genoms während der Entwicklung in utero dar. Daraus ergeben sich zahlreiche Ansatzpunkte für zukünftige Untersuchungen, die in ihrer Gesamtheit ein umfassendes Verständnis der Evolution des menschlichen Gehirns ermöglichen werden.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Technische Universität Dresden

Year

2020

Author dc:creator

• Andrä, Paul

Contributors dc:contributor

• Huttner, Wieland
• Buchholz, Frank

• FAM72
• human neocortical development
• human-specific genes
• in utero electroporation
• transcriptome analysis
• menschenspezifische Gene
• neokortikale Entwicklung
• in utero Elektroporation
• Transkriptomanalyse