{"id":{"repo_id":"qucosa-diss","oai_identifier":"oai:qucosa:de:qucosa:72801"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/qucosa-diss/oai:qucosa:de:qucosa:72801","repository":{"repo_id":"qucosa-diss","name":"QUCOSA","base_url":"http://www.qucosa.de/oai/"},"display":{"title":"HCV Resistenztestung","abstract":"Einleitung: Laut Schätzungen der WHO sind 150.000.000 Menschen mit einer chronischen Hepatitis C infiziert und 700.000 sterben jährlich an den Folgen der Erkrankung. Die antivirale Therapie der Vergangenheit wurde mittels Interferon alpha und Ribavirin durchgeführt. Diese Therapie war für die Patienten mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen verbunden und führte in vielen Fällen nicht zu einem anhaltenden virologischen Ansprechen (SVR) nach Therapieende. Seit Einführung der Direct Acting Antivirals (DAA) können in der Therapie der chronischen Hepatitis C SVR-Raten von über 90 % erreicht werden. Therapieversagen sind auf Resistance Associated Mutations (RAM) in der NS3-, NS5A- oder NS5B-Region zurückzuführen. Fragestellung: Die Entwicklung einer Methode zur genotypspezifischen Resistenztestung, die neben Forschungsaspekten vor allem auch für den Einsatz in der virologischen Diagnostik geeignet ist, ist Gegenstand dieser Arbeit. Aufgrund der Häufigkeitsverteilung der HCV-Genotypen in Deutschland wurde die Entwicklung einer Resistenztestungsmethode auf die Genotypen 1b, 1a und 3a eingegrenzt. Im Fokus dieser Arbeit standen die NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen. An diesen Regionen greifen die DAAs in den Replikationszyklus ein. Material und Methoden: Zur Durchführung der Resistenztestung wurde sich für die nested- bzw. seminested-PCR entschieden. Nach reverser Transkription der viralen RNA und anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA wurde eine präparative Gelelektrophorese durchgeführt. Spezifische Banden wurden manuell extrahiert, aufbereitet und nach der Sanger-Methode sequenziert. Die Sequenzen wurden mit Geneious dargestellt und ggf. manuell nachbearbeitet. Mittels geno2pheno-Onlinedatenbank wurden die Sequenzen auf vorhandene Resistenzmutationen gegenüber DAA untersucht. Es wurden 45 archivierte Serumproben der Genotypen 1a, 1b und 3a mit sich unterscheidender Viruslast und Vortherapie ausgewählt, um die Methode unter möglichst realistischen Untersuchungsbedingungen zu testen. Ergebnisse: Es wurden genotyp- und genlocusspezifische Primersequenzen und PCR-Protokolle für die drei viralen Genregionen NS3, NS5A und NS5B entworfen. Eine single-step-PCR war in vielen Fällen zur erfolgreichen Amplifikation nicht ausreichend, aus diesem Grund wurde die Resistenztestung mittels (semi)nested-PCR durchgeführt. Je nach Genotyp und Region konnten 86 – 100 % der Proben erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden. Eine anschließend durchgeführte Resistenzanalyse erlaubte die Untersuchung von Trends bezüglich des Zusammenhangs zwischen der Art der Vortherapie und dem Auftreten von Resistenzmutationen. Eine statistische Auswertung war nicht Ziel dieser Arbeit und wurde aufgrund der geringen Probenanzahl nicht durchgeführt. Diskussion: Es gelang in dieser Arbeit ein Protokoll zu entwickeln, welches sich für HCV-Resistenzanalysen mit Einsatz in der klinisch-virologischen Diagnostik der in Deutschland häufigsten Genotypen 1a, 1b und 3a eignet. Erfreulicherweise wird dieses Protokoll zur HCV-Resistenztestung im Institut für Virologie des Universitätsklinikums Leipzig angewandt. Durch die nested-PCR können die Anteile der NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen, die Resistenz-assoziierten Mutationen enthalten, sicher amplifiziert und sequenziert werden. Fehlamplifikationen sind am ehesten aufgrund von Punktmutationen an den Primerbindungsstellen zu erklären. Durch Selektionsdruck, fehlende proof-reading-Mechanismen und die Ungenauigkeit der Replikation durch die RNA-abhängige-RNA-Polymerase ist die Rate an Neumutationen bei HCV hoch. Eine wesentliche Option zur Verbesserung der HCV-Resistenztestung wäre die Entwicklung eines Protokolls, welches universell für alle Genotypen anwendbar ist.","abstract_html":"Einleitung: Laut Schätzungen der WHO sind 150.000.000 Menschen mit einer chronischen Hepatitis C infiziert und 700.000 sterben jährlich an den Folgen der Erkrankung. Die antivirale Therapie der Vergangenheit wurde mittels Interferon alpha und Ribavirin durchgeführt. Diese Therapie war für die Patienten mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen verbunden und führte in vielen Fällen nicht zu einem anhaltenden virologischen Ansprechen (SVR) nach Therapieende. Seit Einführung der Direct Acting Antivirals (DAA) können in der Therapie der chronischen Hepatitis C SVR-Raten von über 90 % erreicht werden. 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Im Fokus dieser Arbeit standen die NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen. An diesen Regionen greifen die DAAs in den Replikationszyklus ein. Material und Methoden: Zur Durchführung der Resistenztestung wurde sich für die nested- bzw. seminested-PCR entschieden. Nach reverser Transkription der viralen RNA und anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA wurde eine präparative Gelelektrophorese durchgeführt. Spezifische Banden wurden manuell extrahiert, aufbereitet und nach der Sanger-Methode sequenziert. Die Sequenzen wurden mit Geneious dargestellt und ggf. manuell nachbearbeitet. Mittels geno2pheno-Onlinedatenbank wurden die Sequenzen auf vorhandene Resistenzmutationen gegenüber DAA untersucht. Es wurden 45 archivierte Serumproben der Genotypen 1a, 1b und 3a mit sich unterscheidender Viruslast und Vortherapie ausgewählt, um die Methode unter möglichst realistischen Untersuchungsbedingungen zu testen. 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Erfreulicherweise wird dieses Protokoll zur HCV-Resistenztestung im Institut für Virologie des Universitätsklinikums Leipzig angewandt. Durch die nested-PCR können die Anteile der NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen, die Resistenz-assoziierten Mutationen enthalten, sicher amplifiziert und sequenziert werden. Fehlamplifikationen sind am ehesten aufgrund von Punktmutationen an den Primerbindungsstellen zu erklären. Durch Selektionsdruck, fehlende proof-reading-Mechanismen und die Ungenauigkeit der Replikation durch die RNA-abhängige-RNA-Polymerase ist die Rate an Neumutationen bei HCV hoch. 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