Primäre Leberzellen und ihr Beitrag zur sinusoidalen extrazellulären Matrix - Eine Genexpressionsstudie

Die Leber ist ein zentrales Organ für den Energiestoffwechsel mit großer regenerativer Kapazität. Nach akut schädigenden Einflüssen und selbst nach Entfernen von bis zu 80% des effektiven Lebervolumens kann sich die Leber zu voller Funktionsfähigkeit regenerieren (Fausto und Campbell 2003; Guglielmi et al. 2012). Anhaltende Schädigungen können hingegen über eine chronische Entzündungs- und Wundheilungsreaktion zu einem fortschreitenden bindegewebigen Umbau und damit verbundenem Funktionalitätsverlust führen (Anthony et al. 1978). Für fortgeschrittene fibrotische und zirrhotische Leberveränderungen gibt es bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten, sodass bei terminalem Leberversagen die Lebertransplantation die einzig kurative Strategie darstellt. Die komplexen Stoffwechsel- und Syntheseleistungen der Leber vollführen Hepatozyten in der kleinsten Baueinheit des Lebergewebes, dem Sinusoid. In diesem hochdifferenzierten Kompartiment befinden sich außerdem Kupffer-Zellen, hepatische Stellatzellen und Endothelzellen als residente nicht-parenchymale Leberzellen und verhältnismäßig wenig extrazelluläre Matrix. Dieses dreidimensionale makromolekulare Netzwerk und dessen besondere Komposition scheinen von zentraler Bedeutung zu sein, da hierdurch das differenzierte Umfeld der Hepatozyten geschaffen und aufrechterhalten wird. Im Zuge von Leberschädigungen, wie der Fibrose, verändert es sich eindrucksvoll durch vermehrte Matrixdeposition und einen progredienten bindegewebigen Umbau. Es gibt bis dato wenig Daten, welche die Expression von extrazellulären Matrixbestandteilen des humanen Sinusoids konsequent nach einzelnen Zelltypen aufschlüsseln. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Komposition und einzelne produktive Beiträge durch residente Leberzellpopulationen auf Transkriptebene zu analysieren. Aus humanen Gewebeproben gesunder und unterschiedlich geschädigter Lebern wurden primäre Zellen isoliert. Die enthaltene RNA wurde aufgereinigt und mittels quantitativer Echtzeit-PCR auf die Expression 28 leberrelevanter extrazellulärer Matrixgene untersucht. Unterschiede in der Expression wurden mittels Hauptkomponentenanalyse und linearer Modellierung analysiert. In der vorliegenden Arbeit konnten, von 28 untersuchten, 24 Gene aus den drei funktionellen Proteingruppen fibrillärer Kollagene, Basalmembrankomponenten und regulatorischer extrazellulärer Matrix-Proteine nachgewiesen werden. Gene fibrillärer Kollagene, insbesondere COL3A1, deren Produkte als wachsende Hauptmatrixkomponenten des fibrotischen Sinusoids etabliert sind, wurden auch in den untersuchten fibrotischen Proben signifikant hochreguliert. Ähnliche Tendenzen zeigten sich in durch Chemotherapie geschädigten Proben. Die erhobenen Daten legen nahe, dass die nicht-parenchymalen Leberzellen quantitativ ausschlaggebend zur Matrix-Expression beitragen, während primäre Hepatozyten eine untergeordnete Rolle spielen. Stellatzellen und daraus differenzierende (Myo-)Fibroblasten sind in der Literatur als Hauptproduzenten von Matrixkomponenten etabliert. Obwohl die untersuchten Stellatzellen alle detektierten Matrixgene in messbaren Mengen exprimierten, zeigten sie sich weder besonders hoch noch differentiell reguliert. Die Ergebnisse legen außerdem nahe, dass die Produktion und einige Regulationsmechanismen eher von Kupffer-Zellen und Endothelzellen ausgehen, welche bisher nicht zu den klassischen matrixproduzierenden Zellen gezählt werden. Die Experimente zeigten, dass in Kupffer-Zellen ein Set von neun, basalmembranösen und regulatorischen Matrixgenen in Fibrose gegenüber gesunden Proben herunterreguliert war. Dies weist auf einen bisher kaum beschriebenen primär produktiven Beitrag zu der Matrixregulation durch Kupffer-Zellen hin. Endothelzellen exprimierten gefäßtypische Kollagen 4 Gene in den gemessenen Daten erwartungsgemäß am höchsten. Darüber hinaus waren in Proben, die durch Chemotherapie geschädigt wurden, einige basalmembranassoziierte und regulatorische Matrixgene durch Endothelzellen hochreguliert. Diese Beobachtung lässt sich gut in den Kontext des sogenannten sinusoidalen Obstruktionssyndroms einordnen, welches einen sinusoidal-kapillären Schaden darstellt, der bereits mehrfach im Zusammenhang mit Chemotherapie beschrieben wurde. Interessanterweise konnte auch das Gen für Tenascin-R, ein eigentlich streng neuronal reguliertes extrazelluläres Glykoprotein, in den untersuchten nicht-parenchymalen Zellproben detektiert werden. Der daraus resultierende Hinweis auf eine temporäre Expression neuronaler bzw. glialer Proteine von residenten Leberzellen stellt ein Novum dar, welches in zukünftigen Studien validiert und weiter erforscht werden könnte. In den Verlauf von Leberschädigungen verschiedener Ätiologien sind höchst dynamische Prozesse involviert. Die Untersuchung primärer Leberzellen auf Transkriptebene hat sich hierbei als wertvolles Werkzeug erwiesen, um pathologieassoziierte Veränderungen der Regulation extrazellulärer Matrixgene zu detektieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie konnten zeigen, dass neben (Myo-)Fibroblasten gerade Kupffer-Zellen und Endothelzellen potente Matrixgenproduzenten und -regulatoren darstellen. Die Berücksichtigung ihres Beitrages und der präzisen Komponenten der Mikroumgebung im homöostatischen Lebersinusoid könnte relevante Verbesserungen von in vitro Leber- und Co-Kultur-Modellen bedeuten und zukünftig lebensnähere Erkenntnisse befördern. Einige konditionsspezifisch differentiell exprimierte Gene, wie zum Beispiel das fibrilläre Kollagengen COL3A1 oder Kollagen 6-Gene, bieten sich möglicherweise als potenzielle Marker akuter und chronischer Leberschäden an. Sie könnten neue Ansätze für die frühe Diagnostik von Leberpathologien darstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten in Zukunft an größeren Stichproben validiert und für weitere Pathologien vertieft werden.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Leipzig

Year

2020

Author dc:creator

• Heinrich, Juliane

• Leberpathologien; Extrazelluläre Matrix; Sinusoid; Genexpression