Indirekte und direkte Methoden zur Detektion des Erythropoietindopings
Das Problem des Missbrauchs von Erythropoietin (EPO) als Dopingsubstanz zur Steigerung der Ausdauerleistung wurde schlagartig weltweit durch den Skandal zur Tour de France 1998 bekannt. Das Internationale Olympische Komitee (IOC) führte ab 1992 Erythropoietin explizit auf der Liste der verbotenen Wirkstoffe auf, ohne des es möglich war zwischen den rekombinantem und dem körpereigene Erythropoietin zu unterscheiden. Bei der im Institut für Dopinganalytik und Sportbiochemie Kreischa durchgeführten Arbeit wurden zwei generelle Strategien verfolgt: zum einen ein indirekter Nachweis des rhEPO, basisierend auf dessen Auswirkungen auf die Erythropoese, und zum anderen der direkte Nachweis des Unterschieds zwischen rekombinantem und humanem Erythropoietin. In der ersten durchgeführten Populationsuntersuchung von 229 Leistungssportlern konnte bei der Auswertung der Daten lediglich eine signifikante Erhöhung des löslichen Transferrinrezeptors (sTfR) bei den Ausdauerathleten gefunden werden, während sich die hämatologischen Parameter nicht unterschieden. In der anschließenden Verlaufsuntersuchung von Ausdauerathleten des Deutschen Leichtathletikverbandes wurden zusätzlich zu den bereits in der Populationsstudie untersuchten Parametern erstmalig von Hochleistungs-athleten Retikulozyten und deren Reifeparameter untersucht. Bei den Hochleistungs-sportlern konnten, insbesondere für die Retikulozyten-parameter, über den Zeitraum der Studie konstante Werte gefunden werden. Die Untersuchung der zirkadianen Rhythmik zeigte lediglich für den Parameter Erythropoietin einen signifikante Veränderung mit einem Maximum in den späten Abendstunden (20:00 bis 23:00 Uhr) erreichte. Die Untersuchung der Variation der indirekten Parameter über den Zeitraum eines Jahres zeigte, dass im Gegensatz zu der Verlaufsuntersuchung der DLV-Athleten, bei der der längste Untersuchungs-zeitraum sechs Monate betrug, eine Veränderung aller Parameter, mit Ausnahme von Erythropoietin, bestand. Bei der Auswertung der Belastungsstudien wurde für die gut trainierten Athleten nur ein geringer Einfluss auf die hämatologischen Parameter gefunden, während bei einigen Retikulozytenparametern signifikante Erhöhungen durch die Belastung festgestellt werden konnten. Mit der Etablierung der direkten Nachweismethode für EPO im Urin und der Anpassung der ursprünglichen Methode an das neue Präparat ARANESP, ein modifiziertes EPO, änderte sich die Aufgabenstellung für die indirekten Parameter, da es ab sofort möglich war eine große Anzahl Proben unter Verwendung von niedrigeren Grenzwerten zu screenen. Anhand der Werte der weltbesten Ausdauerathleten wurden allgemein gültige Grenzwerte und eine globale Strategie für ein Screening aufgestellt. Bei einem auffälligen Befund würde in jedem Fall die korrespondierende Urinprobe mittels der direkten Methode untersucht und erst mit dem Nachweis des rekombinanten Erythropoietins als positiv bewertet werden. Zusätzlich zu den indirekten Parametern wurden Untersuchungen hinsichtlich des direkten Nachweis, d. h. der Anreicherung von Erythropoietin und einer massenspektrometrischen Analyse einzelner Glykanketten, durchgeführt, bei denen mit der Kombination Nanospray und TOF-MS die notwendigen Nachweisgrenzen erreicht werden konnten. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass ausgewählter Blutparameter sehr gut geeignet sind, um als Screeningmethode für erythropoesesteigernde Substanzen zu dienen. Im Gegensatz zur Methode des direkten Nachweises von EPO im Urin, die durch die Verfügbarkeit der Referenzsubstanzen limitiert ist, bietet der indirekte Nachweis über Blutparameter den Vorteil, Veränderungen des erythropoetischen Systems, verursacht durch neue Substanzen oder Methoden, erfassen zu können.
ARANESP, Blutproben, Doping, Erythropoietin, Glykane, Massenspektrometrie, Retikulozyten, isoelektrische Fokussierung, blood samples, glycane, isoelectric focusing, mass spectrometry, reticulocyte
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