Analytik von phenolischen Substanzen und Epoxiden in Materialien mit Lebensmittel- und/oder dermalem Kontakt
Ein Großteil der Lebensmittel wird in der heutigen Zeit vor allem aufgrund ihrer langen Haltbarkeit in Konservendosen verpackt. Zur Qualitätserhaltung des Lebensmittels werden Weißblechdosen im Innenbereich in der Regel mit einer Lackierung versehen. Lackrohstoffe sind dabei u. a. Phenol- und Epoxidharze, die als Basis- oder Vernetzerkomponente eingesetzt werden. Bei der Herstellung und Lagerung dieser Lebensmittel kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zur Migration von Bestandteilen aus der Kunststoffinnenbeschichtung in das Füllgut kommt. Toxikologisch und somit auch analytisch sind dabei vor allem die migrierenden Verbindungen unter 1000 Da von Interesse, da Substanzen mit einer Molmasse von über 1000 Da nur zu weniger als 1 % im Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. Analytik von phenolischen Verbindungen Bei Untersuchungen zur Migration phenolischer Verbindungen unter Verwendung verschiedener Modellcoatings und Simulanzlösemittel wurden Konzentrationen an migrierenden phenolischen Substanzen in Summe bis 160 µg/dm² bestimmt, womit dieser Gehalt deutlich unter dem gesetzlichen Grenzwert für die Gesamtmigration von 10 mg/dm² liegt. Die Quantifizierung erfolgte dabei über SEC-FLD-Kalibriergeraden der für diese Coatings verwendeten Phenolharze. Tendenziell steigt dabei die Menge an übergehenden Verbindungen mit abnehmender Polarität der verwendeten Simulanzien. Ebenso abhängig vom Lösungsmittel ist die Molekulargewichts¬verteilung der im Migrat enthaltenen Phenole. So zeigte sich eine deutliche Verschiebung der phenolischen Verbindungen zu höheren Molekulargewichten mit abnehmender Polarität der Simulanzlösemittel. Mit wenigen Ausnahmen besitzen jedoch alle migrierenden Substanzen eine Molmasse von unter 1000 Da. Das beobachtete Migrationsverhalten kann u. a. auf die unterschiedliche Reaktivität der phenolischen Basismonomere der Harze zurückgeführt werden, wodurch die Fähigkeit variiert, unter den Einbrennbedingungen ein ausgeprägtes Netzwerk zu bilden. Zur näheren Charakterisierung der Phenolharze wurden einzelne Hauptverbindungen der RP-HPLC-FLD-Chromatogramme identifiziert. Über Derivatisierungsreaktionen mit Picolinsäure, Essigsäureanhydrid sowie Dansylchlorid konnten Informationen zur Anzahl an alkoholischen und phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül erhalten werden. Mit dem Wissen um die eingesetzten Phenolmonomere und einer eventuellen Veretherung konnten Strukturvorschläge erstellt werden. Die Quantifizierung der migrierenden phenolischen Verbindungen in Migraten kommerzieller Coatings in Summe wurde über eine universell anwendbare Kalibrierung angestrebt. Dazu wurden 17 verschiedene Phenolharze bezüglich der Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden, des mittleren Molekulargewichtes, der Hydroxylzahl und dem Verhältnis OH-Gruppen/Molekül charakterisiert. Wie erwartet steigt mit wenigen Ausnahmen die Anzahl der OH-Gruppen im Molekül tendenziell mit dem mittleren Molekulargewicht. Es zeigte sich zudem, dass die verschiedenen Phenolharze in ihren fluorophoren Eigenschaften stark variieren. Die Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden konnte zudem in keine Korrelation mit einem anderen ermittelten Parameter gebracht werden. Die Anwendung einer universellen Kalibriergerade zur Quantifizierung war deshalb nicht möglich. Die Größenordnungen der Migratkonzentrationen konnten daher nur über die zwei im Anstieg am stärksten variierenden SEC-FLD-Kalibriergeraden abgeschätzt werden. Bei der Analyse kommerzieller Epoxy-Phenol-Coatings war im Gegensatz zu Polyester-Phenol-Coatings die isolierte Detektion der phenolischen Verbindungen im Migrat mittels Fluoreszenz nicht möglich, da sowohl Epoxide als auch Phenole fluorophorer Eigenschaft besitzen. Es wurde daher eine Methode zur Abtrennung der Phenole von anderen im Migrat enthaltenen Subtanzen auf Basis eines Anionenaustauschermaterials entwickelt. Dabei wurde die Eigenschaft der Phenole genutzt, im basischen Milieu Phenolate zu bilden. Diese, aber auch Säuren adsorbieren am Austauschermaterial, während Epoxide oder Polyester nicht retardiert werden. Für zwei kommerzielle Epoxy-Phenol-Coatings konnte somit der Anteil an phenolischen Verbindungen im Migrat zu 7 und 28 % bestimmt werden. Mittels RP-HPLC/ESI-MS war es möglich, einige der phenolischen Verbindungen in diesen Migraten zu identifizieren. Dabei handelt es sich um nichtepoxidierte BPA-Derivate der Epoxidkomponente des Coatings, die aufgrund des BPA-Grundkörpers eine phenolische Hydroxylgruppe besitzen. Phenolische Vernetzungsprodukte beider Basisharze konnten dagegen nicht identifiziert werden. Die Menge an migrierenden phenolischen Verbindungen der beiden Epoxy-Phenol-Coatings konnte über die Kalibration eines niedermolekularen Epoxidharzes zu 0,1 mg/dm² bzw. 0,27 mg/dm² abgeschätzt werden. Während für einzelne phenolische Verbindungen gesetzliche Grenzwerte für die Migration bestehen, gibt es für Oligomere, mit Ausnahme von BPA keine spezifischen Migrationslimits. Ebenso sind in der Literatur kaum toxikologische Untersuchungen zu Phenololigomeren zu finden. Um einen ersten Einblick in die toxikologische Relevanz migrierender phenolischer Verbindungen zu erhalten, wurden mehrere kommerzielle als auch selbst synthetisierte phenolische Standardsubstanzen und verschiedene Molekulargewichtsfraktionen eines Phenolharzes, im Fischembryotest an Eiern des Zebrabärblings (Brachydanio rerio) nach DIN 38415-T647 und/oder Neutralrottest an Hep-G2 und HT-29 Zellen untersucht. Die stärksten Effekte im Fischembryotest bewirkte das Trimer BPM, hier reichte bereits eine Konzentration von etwa 2 mg/l aus, um 50 % der Fischembryonen letal zu schädigen. Im Gegensatz dazu waren beim Dimer 5-Hydroxymethyl-2,4´-dihydroxydiphenylmethan (M 230) mit einem EC50-Wert von 170 mg/l die geringste toxikologische Wirkung zu beobachten. Für alle anderen Subtanzen konnten EC50-Werte im Bereich 20 - 100 mg/l bestimmt werden. Tendenziell zeichnete sich dabei eine Zunahme der EC50-Werte mit steigender Lipophilie, ausgedrückt über den KOW-Wert ab, was auf den Aufbau der Fischeier zurückzuführen ist. So müssen die zu untersuchenden Xenobiotika mehrere lipophile Membranen durchdringen, um am eigentlichen Wirkungsort Einfluss auf die Embryonalentwicklung nehmen zu können. Im Zelltest konnten tendenziell ähnliche Ergebnisse ermittelt werden wie im Fischembryotest, wobei in der Regel die Hep-G2 Zellen empfindlicher reagieren als die HT-29 Zellen. Während für Phenol im untersuchten Konzentrationsbereich keine toxischen Effekte beobachtet werden konnten, liegen die EC50-Werte für das Trimer BPM, analog zum Fischembryotest deutlich unter 10 mg/l. Für die anderen Verbindungen wurden EC50-Werte zwischen 16 und 100 mg/l bestimmt. Analog zu den Untersuchungen der Einzelsubstanzen zeigte sich auch bei den 5 untersuchten Molekulargewichtsfraktionen zwischen 0 und 1000 Da, dass das toxikologische Potential im niedermolekularen Bereich (0 - 200 Da) gegenüber den Fraktionen 200 400 und 400 600 Da vergleichsweise gering ist. Bereits 25,1 mg/l bzw. 17,3 mg/l der Fraktionen 200 400 Da und 400 600 Da waren in den Tests ausreichend, um alle Embryonen letal zu schädigen. Im Molekulargewichtsbereich über 600 Da konnten dagegen lediglich subletale oder gar keine Missbildungen beobachtet werden. Analytik von Epoxiden In der amtlichen Überwachung beschränkt sich die Analytik von Epoxidverbindungen bisher auf die Bestimmung rechtlich geregelter Einzelsubstanzen. Eine Summenmethode zur Erfassung aller in einem Migrat enthaltenen Substanzen mit reaktionsfähigen Oxirangruppen, wodurch das gesamte Reaktionspotential erfasst werden kann, liegt dagegen nicht vor. Zur selektiven Erfassung aller oxirangruppenhaltigen Verbindungen wurde daher mittels statistischer Versuchsplanung eine Derivatisierung mittels Cysteamin entwickelt. Die Reaktion mit Cysteamin erfolgt dabei nach Abtrennung der Substanzen &gt; 1000 Da mittels Größenausschlusschromatographie. Im Anschluss werden die Derivate durch Zugabe eines Kationenaustauschers aus der Lösung entfernt. Durch den Vergleich der RP-HPLC-FLD Chromatogramme vor und nach der Aufarbeitung können Substanzen mit intakten Oxirangruppen somit einfach erkannt werden. Eine quantitative Abschätzung der enthaltenen Epoxidverbindungen ist bei Lacken auf Basis von BPA-Harzen über die BPA-Chromophorkonzentration möglich. Bei der Untersuchung von 5 kommerziellen Coatings wurden in den einzelnen Migraten recht unterschiedliche Gehalte an Substanzen mit intakten Epoxidgruppen ermittelt. Ebenso ist die Anzahl der oxriangruppenhaltigen Verbindungen, auf die sich dieser Gehalt verteilt sehr unterschiedlich, was möglicherweise an unterschiedlichen Einbrennzeiten, -temperaturen aber auch der Menge an Lack pro m² und an der Art und Menge des Reaktionspartners liegt. Für die Konzentration der epoxidischen Verbindungen in den Coatingmigraten wurden Werte zwischen 18,5 und 835 µg/dm² bestimmt. Dies entspricht einem Anteil der reaktionsfähigen Substanzen an der Fraktion unter 1000 Da berechnet über die Flächen im Chromatogramm zwischen 2,6 und 76,3 %. Neben dem Einsatz als Basismaterial für Konservendoseninnenbeschichtungen werden Epoxidharzsysteme auch in Zubereitungen wie Grundierungen, Füllmassen, Lacken oder Klebstoffen für die Bauchemie vielfach in verschiedenen Mischungen (aromatische, aliphatische oder cycloaliphatische Glycidylether bzw. Siloxanglycidylether) eingesetzt. Durch den Kontakt dieser Materialien mit der Haut kann es zu Kontaktekzemen kommen, deren Ursache durch Epikutantests (Patchtests) mit den potentiell auslösenden Substanzen ermittelt werden kann. Der Umfang der in den Standardtestsystemen enthalten Testsubstanzen entspricht dabei jedoch nicht dem Spektrum der in der Industrie verwendeten Materialien. Über die genaue Zusammensetzung der in den Patchtest´s eingesetzten Materialien ist zudem wenig bekannt. Durch die Analyse einer Vielzahl von Patchtestsubstanzen und industriellen Epoxidkomponenten mittels RP-HPLC/UVD bzw. -ELSD Chromatographie und die Identifizierung der enthaltenen Verbindungen über RP-HPLC/ESI-MSD, konnte ein genaueres Bild über den Charakter dieser Materialen gewonnen werden. Bei den BPA- und BPF-Harzen wurden überwiegend Monomere, die entsprechenden Di- und Trimere aber auch dessen hydrolysierte Verbindungen identifiziert. Im Gegensatz dazu liegen bei den analysierten aliphatischen Produkten z. T. die reinen Glycidylether gar nicht oder nur in geringen prozentualen Anteilen vor. Vielmehr wird durch die sauer geführte Reaktion bei den aliphatischen Verbindungen die Bildung von 1,3 Chlorhydrinen als Nebenreaktion zur 1,2 Chlorhydrinbildung gefördert, wodurch eine beträchtliche Menge an Substanzen, die nicht verseifbares Chlor enthalten, in den Materialien vorhanden ist. Um die enthaltenen Verbindungen von aliphatischen und cycloaliphatischen Epoxidzubereitungen quantifizieren zu können, wurde eine Derivatisierung mit einem selbst synthetisierten Fluorophor (5-(Dimethylamino)-N-(2-mercaptoethyl)-1-naphthalen-sulfonamid) entwickelt. Dadurch konnten auch Verbindungen erfasst werden, die aufgrund ihrer Flüchtigkeit mittels ELSD nicht detektierbar waren. Bei der Analyse von Handelsprodukten zeigte sich, dass die einzelnen Komponenten in ihrer Zusammensetzung gut mit den untersuchten aromatischen und aliphatischen Rohmaterialien vergleichbar sind. Bei entsprechend eingesetzten Patchtestsubstanzen spiegeln diese somit die Produkte gut wieder, mit denen die Patienten in Kontakt kommen.
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