Design of a high-affinity carbohydrate binding protein

Kohlenhydrat-Protein Interaktionen sind in der Natur weitverbreitet. Sie stellen die Grundlage für viele biologische Prozesse dar, wie zum Beispiel Immunantworten, Wundheilung und Infektionsprozesse von pathogenen Viren oder Bakterien mit einem Wirt wie dem Menschen. Neben der Infektion von Menschen können aber auch Bakterien selbst durch so genannte Bakteriophagen infiziert werden, welche für den Menschen ungefährlich sind. Diese Infektion involviert die spezifische Erkennung der pathogenen Bakterien, die Vermehrung der Bakteriophagen und schließlich die Abtötung der Bakterien. Dabei können die Mechanismen der spezifischen Erkennung genutzt werden, pathogene Bakterien auf Lebensmitteln zu detektieren oder die Diagnose von Infektionen zu vereinfachen. Die spezifische Erkennung von Enteritis-erzeugenden Bakterien wie Escherichia coli, Salmonella spp. oder Shigella flexneri durch Bakteriophagen der Familie der Podoviridae erfolgt über die Bindung eines sogenannten tailspike proteins des Bakteriophagen an das aus Kohlenhydraten-bestehende O-Antigen des Lipopolysaccharids von Gram-negativen Bakterien. Das tailspike protein spaltet das O-Antigen um den Bakteriophage an die Oberfläche des Bakteriums zu führen, damit eine Infektion stattfinden kann. Die Affinität des tailspike proteins zum O-Antigen ist dabei sehr niedrig, um nach Spaltung des O-Antigens das Spaltungsprodukt zu lösen und wiederum neues Substrat zu binden. In dieser Arbeit wurde ein tailspike protein des Bakteriophagen Sf6 verwendet (Sf6 TSP), das spezifisch an das O-Antigen von Shigella flexneri Y bindet. Eine inaktive Variante des Sf6 TSP wurde verwendet um einen hoch-affin bindenden Sensor für pathogene Shigella zu entwickeln. Der Shigella-Sensor wurde durch Kopplung von unterschiedlichen Proteinmutanten mit einem fluoreszierendem Molekül erhalten. Dabei zeigte eine dieser Mutanten bei Bindung von Shigella O-Antigen ein Fluoreszenz-Signal im Bereich des sichtbaren Lichts. Molekulardynamische Simulationen wurde anhand der erzeugten Proteinmutanten als Methode zum rationalen Design von hoch-affin Kohlenhydrat-bindenden Proteinen getestet und die resultierenden Affinitätsvorhersagen wurden über Oberflächenplasmonresonanz-Experimente überprüft. Aus weiteren experimentellen und simulierten Daten konnten schließlich Schlussfolgerungen über die Ursprünge von Kohlenhydrat-Protein Interaktionen gezogen werden, die eine Einsicht über den Einfluss von Wasser in diesem Bindungsprozess lieferten.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Potsdam

Year

2017

Author dc:creator

• Kunstmann, Ruth Sonja

Contributors dc:contributor

• Seckler, Robert

• Kohlenhydrat-Protein Interaction
• carbohydrate-protein interaction
• bacterial sensor
• Bakterien Sensor

Statement dc:rights

• Keine öffentliche Lizenz: Unter Urheberrechtsschutz

Repository record source_url

https://publishup.uni-potsdam.de/frontdoor/index/index/docId/40345

OAI identifier oai:identifier

oai:kobv.de-opus4-uni-potsdam:40345