Συνέκφραση και μελέτη υπομονάδων του νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης ανθρώπινων νευρικών κυττάρων
Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChR) αποτελούν πρότυπα μέλη της υπεροικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων διαύλων ιόντων. Εμπλέκονται τόσο σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού, όσο και σε πολλές νόσους προσελκύοντας μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον. Οι nAChR διακρίνονται κυρίως σε νευρικού και μυϊκού τύπου. Ο νευρικός α4β2 nAChR έχει εκφραστεί και μελετηθεί με τεχνικές όπως πρόσδεση αγωνιστών-ανταγωνιστών και ηλεκτροφυσιολογικές αναλύσεις. Όμως δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ, πάνω σε αυτόν τον υποδοχέα δεν έχουν ακόμα αναφερθεί και πιθανή αιτία γι’ αυτό μπορεί να είναι και η ευέλικτη διαμόρφωση της κυτταροπλασματικής θηλιάς μεταξύ των διαμεμβρανικών ελίκων Μ3 και Μ4, η οποία μπορεί να εμποδίζει την ευαίσθητη από τη φύση της διαδικασία της κρυστάλλωσης των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Στην παρούσα μελέτη ο ανθρώπινος α4β2 nAChR εκφράστηκε τόσο σε κύτταρα εντόμων Sf9 με τη βοήθεια βακιλοϊού, όσο και σε ζυμομύκητες P. pastoris, σε δυο μορφές: Τον άγριου τύπου υποδοχέα (ΑΤ) και μια μορφή χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά (Κ). Στόχος της παρούσης μελέτης, ήταν η έκφραση ενός τύπου α4β2 nAChR με την καλύτερη δυνατή ποιότητα δομής και τα υψηλότερα δυνατά επίπεδα έκφρασης, ο οποίος θα ήταν κατάλληλος να χρησιμοποιηθεί σε δομικές μελέτες υψηλής ανάλυση όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ. Αρχικά κατασκευάστηκαν ανασυνδυασμένοι βακιλοϊοί με τα cDNA των υπομονάδων των ΑΤ και Κ α4β2 υποδοχέων, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα εντόμων Sf9 αναγκάζοντάς τα να εκφράσουν τους υποδοχείς. Οι υπομονάδες των ΑΤ και Κ υποδοχέων ανιχνεύτηκαν εκφρασμένες σε κύτταρα εντόμων με στύπωμα western σε αναμενόμενα μοριακά βάρη, ενώ με πρόσδεση 125Ι-επιβατιδίνης αποδείχθηκε ότι οι α4 και οι β2 υπομονάδες είχαν ενωθεί μεταξύ τους μετά την έκφρασή τους και είχαν συγκροτήσει λειτουργικούς θύλακες πρόσδεσης ακετυλοχολίνης. Ο βέλτιστος χρόνος έκφρασης των υποδοχέων βρέθηκε να είναι τα 3 24ωρα, ενώ οι ιδανικές αναλογίες α4 προς β2 βακιλοϊών βρέθηκαν να είναι οι: 1:1 και 1:3. Η προσθήκη νικοτίνης στο θρεπτικό δεν βρέθηκε να έχει κάποια μετρήσιμη επίπτωση στην έκφραση ούτε του ΑΤ ούτε και του Κ υποδοχέα. Πειράματα πρόσδεσης 3Η-επιβατιδίνης έδειξαν τη συγγένειά της με τον ΑΤ υποδοχέα να είναι 2 φορές υψηλότερη σε σχέση με τον Κ, ενώ στα ίδια πειράματα βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Κ υποδοχέα ήταν 7 φορές υψηλότερα από αυτά του ΑΤ. Πειράματα πρόσδεσης μη επισημασμένων προσδετών έδωσαν συγγένειες επίσης δυο φορές υψηλότερες για τον ΑΤ υποδοχέα σε σχέση με τον Κ. Επιπλέον πειράματα διαλυτοποίησης έδειξαν ότι οι βέλτιστες συνθήκες για την διαλυτοποίηση των υποδοχέων ήταν οι 25 oC και η χρήση του απορρυπαντικού Triton X-100. Στην ίδια σειρά πειραμάτων ο Κ υποδοχέας βρέθηκε να διαλυτοποιείται 4 φορές πιο αποδοτικά σε σχέση με τον ΑΤ. Τα πειράματα απομόνωσης και καθαρισμού συνεχίστηκαν μόνο με τον Κ υποδοχέα, λόγω καλύτερης διαλυτοποίησης και πολύ υψηλότερων επιπέδων έκφρασης που παρουσίαζε σε σχέση με τον ΑΤ. Ο Κ α4β2 υποδοχέας απομονώθηκε και καθαρίστηκε αρχικά με χρωματογραφία συγγένειας ιόντων νικελίου και στη συνέχεια με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, η οποία έδειξε ότι ο Κ υποδοχέας είχε εκλουστεί σε όγκο έκλουσης συμβατό με το αναμενόμενο ΜΒ. Το γεγονός αυτό, μαζί με το γεγονός της πρόσδεσης επιβατιδίνης και άλλων προσδετών, πιστοποίησαν ότι οι ταυτόχρονα εκφραζόμενες α4 και β2 υπομονάδες συγκρότησαν υποδοχείς. Η ανάλυση του καθαρισμένου Κ α4β2 υποδοχέα με SDS PAGE και στύπωμα western έδειξε ότι ο υποδοχέας είχε απομονωθεί και καθαριστεί σε ικανοποιητικό βαθμό. Η έκφραση των ΑΤ και Κ υποδοχέων στο στέλεχος GS 115 του ζυμομύκητα P. pastoris δεν ήταν το ίδιο επιτυχημένη με την αντίστοιχη έκφραση σε κύτταρα εντόμων. Οι υπομονάδες των υποδοχέων δεν ανιχνεύτηκαν στην ανάλυση με στύπωμα western, ενώ η ανάλυση με δέσμευση 3Η-επιβατιδίνης έδειξε ότι εκφράστηκαν σε επίπεδα πολύ χαμηλότερα σε σχέση με αυτά των κυττάρων εντόμων. Τέλος τα ποσοστά διαλυτοποίησης που επιτυγχάνονταν με τον ζυμομύκητα P. pastoris ήταν επίσης πολύ χαμηλότερα από τα αντίστοιχα των κυττάρων εντόμων, οπότε η μελέτη δεν προχώρησε περεταίρω με αυτό το σύστημα έκφρασης. Συμπερασματικά μέσα από την παρούσα μελέτη, προέκυψε ένας ανθρώπινος νευρικός α4β2 nAChR χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά, εκφρασμένος σε κύτταρα εντόμων με τη βοήθεια βακιλοϊού, ο οποίος εκφράζεται και διαλυτοποιείται πολύ περισσότερο από τον φυσικό υποδοχέα και επιπλέον μπορεί να απομονωθεί και να καθαριστεί σχετικά εύκολα. Η απουσία της εύκαμπτης κυτταροπλασματικής θηλιάς αναμένεται να διευκολύνει τον σχηματισμό κρυστάλλων του υποδοχέα στα πειράματα κρυστάλλωσης, τα οποία έχουν ήδη ξεκινήσει, καθώς και την ανάλυση των δεδομένων εφόσον προκύψουν πρωτεϊνικοί κρύσταλλοι. Τέλος οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση ΑΤ και Κ α4β2 nAChR μεταξύ κυττάρων εντόμων και ζυμομύκητα P. pastoris, ελέγχθηκαν εκφράζοντας στα συστήματα αυτά μια μικρότερη, συγγενική πρωτεΐνη, η οποία αποτελείτο μόνο από το ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου μυϊκού τύπου nAChR. Το εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων α1-ECD (i-α1-ECD) βρέθηκε να έχει μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενών σε σχέση με το εκφρασμένο σε ζυμομύκητα P. pastoris (y-α1-ECD), καθώς επίσης μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR mAb, αποτελέσματα τα οποία μαζί με αντίστοιχα του κυκλικού διχρωϊσμού έδειξαν βελτιωμένη δομή, επιβεβαιώνοντας ότι τα κύτταρα εντόμων εκφράζουν καλύτερα nAChR σε σχέση με το ζυμομύκητα P. pastoris. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι το i-α1-ECD είναι καταλληλότερο τόσο για δομικές μελέτες όσο και για βελτιωμένες θεραπείες της βαριάς μυασθένειας.
Υποδοχέας ακετυλοχολίνης, Νευρικός, α4β2, Κύτταρα εντόμων, 612.814, Acetylcholine receptor, Neuronal, Insect cells
Networked Digital Library of Theses and Dissertations