Ανάπτυξη και αξιολόγηση συστημάτων χορήγησης πεπτιδικών αντιγόνων HER-2/neu συνδεδεμένων με PLA μικροσφαίρες
Παρά τις προόδους των κλασικών θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο, η μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών υποτροπιάζει και καταλήγει. Η ανάγκη για την αντιμετώπιση της νόσου με εναλλακτικό τρόπο οδήγησε στην ανάπτυξη ανοσοθεραπευτικών μεθόδων. Η ιδέα της ανοσοθεραπείας του καρκίνου έγινε γνωστή στα τέλη του δέκατου ένατου αιώνα, όταν ο William Coley χρησιμοποίησε ζωντανά στελέχη του πυογενούς βακτηρίου Streptococcus erysipelas με σκοπό τη δημιουργία γενικευμένης ανοσολογικής απάντησης, μέρος της οποίας να κατευθυνθεί ενάντια σε όγκους σαρκώματος. Οι σποραδικές θετικές αποκρίσεις που παρατήρησε οφείλονταν κατά πάσα πιθανότητα σε ενίσχυση της ανοσολογικής απάντησης από τις φλεγμονώδεις αντιδράσεις που προκάλεσαν τα βακτήρια. Για να επαχθεί όμως ειδική ανοσολογική απάντηση ενάντια σε όγκους απαιτείται να χαρακτηριστούν στα καρκινικά κύτταρα συγκεκριμένα αντιγόνα, ώστε να δύναται το ανοσολογικό σύστημα να τα αναγνωρίσει ως στόχους. Συνεπώς, το πρώτο βήμα στην προσπάθεια για ανοσοθεραπεία του καρκίνου είναι η απομόνωση αντιγόνων που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία κατά προτίμηση να μην εκφράζονται από τους φυσιολογικούς ιστούς ώστε να αποφευχθεί η αυτοάνοση απάντηση. Η ταυτοποίηση ογκοειδικών αντιγόνων, τα οποία αναγνωρίζονται από τα Τ λεμφοκύτταρα, έδωσε ιδιαίτερη ώθηση στην ανάπτυξη της κατευθυνόμενης από τα Τ κύτταρα ανοσολογικής απάντησης, στο επίπεδο τόσο της έρευνας της ανοσολογίας του καρκίνου, όσο και της κλινικής ανοσοθεραπευτικής εφαρμογής και έθεσε τις βάσεις για τη χρησιμοποίηση πεπτιδικών εμβολίων στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Από την πληθώρα των γνωστών καρκινικών αντιγόνων, έχουν ταυτοποιηθεί κατά κύριο λόγο επίτοποι ικανοί να συνδεθούν με μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξης Ι και συνεπώς να επάγουν την ενεργοποίηση των CD8+ T κυττάρων, δεδομένου ότι οι περισσότεροι όγκοι είναι θετικοί ως προς τα μόρια MHC τάξης Ι, αλλά αρνητικοί ως προς τα μόρια MHC τάξης ΙΙ. Επιπρόσθετα, τα CD8+ Τ κύτταρα μπορούν να καταστρέφουν τα καρκινικά κύτταρα απευθείας, μέσω της αναγνώρισης του συμπλόκου MHC τάξης Ι-πεπτιδίου που εκφράζεται στην επιφάνεια του όγκου. Τα τελευταία χρόνια, δεδομένης της αναγνώρισης του κεντρικού ρόλου των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων στην έναρξη, οργάνωση και διατήρηση της ανοσολογικής απάντησης, έχουν αναγνωριστεί και αρκετοί επίτοποι που αναγνωρίζονται από μόρια MHC τάξης ΙΙ. Πρόσφατες κλινικές μελέτες και προκλινικά μοντέλα έδειξαν ότι ο εμβολιασμός με επιτόπους που δύνανται να συνδεθούν με μόρια MHC τάξης ΙΙ, οι οποίοι εμπεριέχουν αλληλουχίες σύνδεσης για τα μόρια MHC τάξης Ι, είναι αποτελεσματικοί στην ταυτόχρονη ανάπτυξη βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων με μακρά διάρκεια ζωής in vivo. Από τα γνωστά καρκινικά αντιγόνα, η πρωτεΐνη HER-2/neu παρουσιάζει το πλεονέκτημα της υπερέκφρασης σε ποικίλους τύπους καρκίνου, ενώ οι ασθενείς των οποίων όγκοι την υπερεκφράζουν παρουσιάζουν προϋπάρχουσα ανοσία ενάντια σε πεπτίδια αυτής. Η αυξημένη έκφρασή της στα καρκινικά κύτταρα και το γεγονός ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη την καθιστούν στόχο για ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις που περιλαμβάνουν τόσο κυτταρική όσο και χυμική ανοσία. Κλινικές έρευνες με χρήση πεπτιδίων της HER-2/neu έχουν δείξει την πρόκληση ανοσολογικής απάντησης στην πλειονότητα των ασθενών. Παρόλα αυτά, οι μεταστατικοί τύποι καρκίνου που υπερεκφράζουν τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη παραμένουν μη θεραπεύσιμοι. Συνεπώς, υπάρχει άμεση ανάγκη για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις και στο σημείο αυτό η διερεύνηση των πιο ανοσογονικών τμημάτων της αλληλουχίας της πρωτεΐνης HER-2/neu, καθώς και της αντίδρασης των ασθενών σε αυτά, αποτελούν στόχο για ειδικές νέες αντικαρκινικές θεραπείες. O εγκλεισμός του αντιγόνου σε μικροσφαίρες πολυ-γαλακτικού-γλυκολικού οξέος (PLGA) έχει δειχθεί ότι επάγει ισχυρή και παρατεταμένη ανοσοαπόκριση. Μέχρι σήμερα, δεν φαίνεται να έχει αναφερθεί μελέτη στην οποία να αναλύεται η επίδραση των χαρακτηριστικών του PLGA συμπολυμερούς και του σχήματος ανοσοποίησης στον τύπο της λαμβανόμενης ανοσοαπόκρισης μετά την χορήγηση PLGA μικροσφαιρών του αντιγόνου in vivo. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο τύπος της ανοσοαπόκρισης που λαμβάνεται in vivo μετά την χορήγηση πεπτιδίων της HER-2/neu (πρότυπα αντιγόνα) συνδεμένων σε πολυ-γαλακτικού οξέος (PLA) και PLGA μικροσφαίρες. Τα πρότυπα αντιγόνα ήταν δύο: * το πεπτίδιο GSPYVSRLLGICLTSTVQLVQL, που αντιστοιχεί στην περιοχή 778-799 της ογκοπρωτεΐνης HER-2/neu. Η πεπτιδική αυτή ακολουθία περιλαμβάνει τον κυτταροτοξικό επίτοπο CLTSTVQLV (789-797) σε συνδυασμό με τον T βοηθητικό (Th) επίτοπο GSPYVSRLLGICL (778-790) της συγκεκριμένης ογκοπρωτεΐνης. * καθώς και το πεπτίδιο CLTSTVQLV (789-797), δηλαδή μόνο ο κυτταροτοξικός (CTL) επίτοπος. Ως πειραματόζωα στην συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν HHD διαγονιδιακοί μύες, οι οποίοι εκφράζουν ανθρώπινα HLA-A2.1 μόρια ιστοσυμβατότητας, δεδομένου ότι η ακολουθία του πεπτιδίου που έχει επιλεγεί προέρχεται από την ανθρώπινη HER-2/neu. Η μετατροπή της ανοσοαπόκρισης Th2 τύπου, εναντίον διαλυτών αντιγόνων που εκφράζονται σε καρκινικούς όγκους, σε Τh1 τύπο ανοσοαπόκρισης είναι σημαντική στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Η δημιουργία αντιγονο-ειδικών CD8+ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων, σε συνέργεια με τα αντίστοιχα βοηθητικά Τ (CD4+) λεμφοκύτταρα, πιστεύεται ότι θα οδηγήσουν στην απόρριψη του όγκου ή στην επιβράδυνση της ανάπτυξης αυτού. Η ταυτοποίηση του τύπου της ανοσοαπόκρισης έγινε με την ανάπτυξη ανοσοαναλυτικών τεχνικών για την μέτρηση των ολικών ειδικών ανοσοσφαιρινών IgG, των ισοτύπων αυτών (IgG1 και IgG2a). Επίσης προσδιορίσθηκε ο τύπος της ανοσοαπόκρισης σε κυτταρικό επίπεδο με την ανάπτυξη τεχνικών μέτρησης της ικανότητας του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων και με μέτρηση των κυτοκινών, κυρίως σε υπερκείμενα καλλιεργειών λεμφοκυττάρων, αλλά και στο αίμα. Για την χορήγηση χρησιμοποιήθηκαν μικροσφαίρες PLA και PLGA με φορτωμένο το αντιγόνο με δύο διαφορετικούς τρόπους (προσροφημένο ή απλά αναμεμιγμένο). Η in vivo χορήγηση του πεπτιδικού αντιγόνου που απλά και μόνο αναμίχθηκε με PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση που ήταν συγκρίσιμη με αυτήν που προκλήθηκε από το συνδυασμό του αντιγόνου με πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund (CFA). Επιπλέον, μετά από ανάλυση του προφίλ των κυτοκινών που εκκρίνονται από τα Τ λεμφοκύτταρα των ανοσοποιημένων μυών, αποδείχθηκε ότι ο συνδυασμός του αντιγόνου πεπτιδίων με τις PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή Th1 ανοσολογική απόκριση στο αντιγόνο. Ο χρόνος της επώασης πεπτιδίων με τις μικροσφαίρες πριν από τη χορήγηση δεν είχε επιπτώσεις στην ανοσολογική απόκριση, γεγονός που απλοποιεί περαιτέρω την παραγωγή σε ευρεία κλίμακα αυτού του τύπου εμβολίων. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από αυτή τη μελέτη δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση σε in vivo πειραματικά μοντέλα καρκίνου της δυνατότητας επαγωγής ισχυρής κυτταρικής ανοσοαπόκρισης έναντι των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την HER-2/neu πρωτεΐνη με απλή ανάμιξη κατάλληλων πεπτιδικών αντιγόνων της HER-2/neu με PLA μικροσφαίρες.
Μικροσφαίρες, Καρκίνος μαστού, Ανοσοαπόκριση, Πεπτίδια, Εμβόλια, 616.994 061, HER-2/neu, PLA, Microspheres, Breast cancer, Immune response, Peptides, Th1/Th2, Vaccines
Networked Digital Library of Theses and Dissertations