Study of porphyrins and heterodimers targeting ABCG2 transporter and development of a multiplexed flow cytometric approach for detection of anti SARS-CoV-2 IgG, IgM and IgA

Resumo: O transportador ABCG2 possui papel central na resistência a múltiplas drogas, porém, nenhum inibidor específico de ABCG2 foi testado em ensaios clínicos. A família de transportadores ABC transporta uma grande variedade de substratos, mas fotossensibilizadores baseados em estruturas porfirínicas são reconhecidos exclusivamente por ABCG2. No capítulo 1 foi descrita pela primeira vez uma porfirina (4B) capaz de inibir o transportador ABCG2 e de ressensibilizar células resistentes in vitro. A inibição foi dependente do tempo de incubação e 4B não se comportou como substrato de ABCG2. A porfirina 4B demonstrou IC50 de 1.6 µM e tipo de inibição mista, independente do substrato. 4B inibiu a atividade ATPasica e aumentou a ligação do anticorpo conformacional 5D3. O ensaio de termo-estabilidade confirmou as alterações alostéricas na proteína desencadeadas pela ligação da porfirina. Simulações de dinâmica molecular revelaram um comportamento distinto entre porfirina 4B e o substrato Pheophorbide a. Pheophorbide a foi capaz de ligar-se em três regiões diferentes da proteína enquanto 4B apresentou apenas região de interação na proteína, apresentando forte interação iônica com aminoácido GLU446. A inibição foi seletiva já que não foi observada inibição em P-gP nem em MRP1. Porfirina 4B foi capaz de ressensibilizar células que superexpressam o transportador ABCG2. Estes achados reforçam a ideia de que substratos podem ser uma fonte privilegiada de estruturas para identificação de novos inibidores para transportadores ABC associados a resistência à múltiplas drogas. Baseados nos resultados mostrados no capítulo 1, outras macromoléculas foram sintetizadas para avaliar os efeitos de heterodímeros construídos a partir de moléculas conhecidamente bioativas. Quatro heterodimeros foram propostos, mas apenas dois foram sintetizados com sucesso (BODIPY-colesterol e Chalcona-colesterol). Resultados preliminares sugerem que BODIPY-colesterol não se comporta como substrato de ABCG2 e que o colesterol não alterou o efluxo de mitoxantrona e hoechst 33342 mediado por ABCG2. Por sua vez, o colesterol anula o efeito da chalcona já que o heterodimero chalcona-colesterol modificou o perfil inibitório quando comparado à chalcona sozinha. Estes resultados trazem novas ideias sobre o papel do colesterol sobre ABCG2. Esta tese foi desenvolvida num contexto de pandemia do COVID-19 que trouxe a necessidade urgente do desenvolvimento rápido de novas metodologias para detecção de anticorpos anti-SARS-CoV-2. No capítulo 3 está descrita uma estratégia inovadora para detecção simultânea das imunoglobulinas IgG, IgM e IgA em pacientes com COVID-19. A proteína Nucleopcapsídeo foi covalentemente ligada à superfície de beads funcionalizadas através do linker sulfo-SMCC. Anti - IgG BUV395, anti-IgM BB515, anti-IgA1/IgA2 biotinilado e streptavidina BV421 foram usados como anticorpos secundários. As condições de incubação e diluição do soro foram otimizadas para detecção de cada isotipo de anticorpo e o ensaio multiplex foi então desenvolvido. Este novo ensaio livre de células foi capaz de diferenciar de maneira eficiente amostras positivas e negativas para COVID-19. A detecção simultânea de IgG, IgM e IgA apresentou sensibilidade de 88.5 - 96.2% e especificidade de 100%. Esta estratégia nova abre um novo caminho para diagnósticos baseados em citometria de fluxo.

Author dc:creator

• Zattoni, Ingrid

Advisor dc:contributor.advisor

• Valdameri, Glaucio, 1984-

• Porfirina e compostos de porfirina
• COVID-19 (doença)
• Substrato
• Farmácia

Language dc:language

Inglês

Handle dc:identifier.uri

https://hdl.handle.net/1884/87739

OAI identifier oai:identifier

oai:acervodigital.ufpr.br:1884/87739