IMPAIRMENT OF TOLL-LIKE RECEPTOR 9 AGONIST ANTI-TUMOR ACTIVITY BY ANTI-PD-1 ANTIBODY: ROLE OF MACROPHAGES

Introduzione: Gli agonisti del recettore Toll-like 9 (TLR9) sono noti per la loro capacità di attivare le cellule del sistema immunitario innato e sono stati ampiamente studiati per il trattamento di diversi tipi di tumore. Tuttavia, ad oggi non sono stati raggiunti risultati soddisfacenti. Infatti, per prevenire reazioni immunitarie incontrollate e potenzialmente dannose, l’attivazione del TLR9 induce diversi meccanismi immunoregolatori che, in ultima istanza, possono inibire la risposta immunitaria. A questo proposito, è stato osservato che la stimolazione del TLR9 provoca un aumento dell’espressione del recettore PD-1 sulle cellule immuni. PD-1 è espresso dalle cellule del sistema immunitario sia innato sia adattativo e, in seguito al legame con i suoi due ligandi (PD-L1 e –L2), provoca lo spegnimento dell’attività del sistema immunitario. Per sfuggire alla risposta immunitaria, le cellule tumorali possono sfruttare l’asse PD-1/PD-Ls grazie all’over-espressione dei ligandi di PD-1. Il blocco di PD-1 mediante specifici anticorpi monoclonali, che impediscono l’interazione tra PD-1 e i suoi ligandi, può ripristinare l’attività delle cellule immunitarie. Tuttavia, solamente il 30% dei pazienti con tumore in stadio avanzato trae beneficio da questo tipo di terapia. Di conseguenza, una coterapia basata sull’attivazione del sistema immunitario mediante agonisti del TLR9, e sul blocco di un meccanismo immunosoppressivo, utilizzando un anticorpo anti-PD-1, rappresenta una promettente strategia immunoterapeutica per il trattamento del cancro. Scopo: L’efficacia della co-somministrazione di questi due farmaci è stata largamente studiata in molteplici studi preclinici e clinici, che si sono focalizzati principalmente sul ruolo del sistema immunitario adattativo. Poichè le cellule immunitarie innate, che possono esprimere PD-1, rappresentano i principali target degli agonisti del TLR9, lo scopo di questo studio è stato la valutazione del ruolo delle cellule del sistema immunitario innato nel determinare gli effetti della co-terapia. Metodi: Un agonista del TLR9 (CpG-ODN) e un anticorpo anti-PD-1 sono stati somministrati, singolarmente o in combinazione, a topi atimici xenotrapiantati intraperitonealmente con cellule IGROV-1 del carcinoma ovarico umano. I macrofagi sono stati depletati in vivo mediante clodronato incapsulato nei liposomi. Il microambiente tumorale è stato valutato con analisi di immunofluorescenza. Sono stati effettuati studi in vitro trattando la linea cellulare di macrofagi murini RAW264.7 con CpG-ODN e/o anticorpo anti-PD-1. L’effetto della combinazione sui macrofagi è stato valutato con analisi del profilo di espressione genica seguite da analisi bioinformatiche, Real-time PCR, multiplex ELISA e saggi di rilascio del 51Cr. Per investigare il ruolo specifico del sito di legame con l’antigene e del dominio del frammento cristallizzabile (Fc) dell’anticorpo anti-PD-1, sono stati utilizzati anticorpi anti-PD-1 ingegnerizzati. Il coinvolgimento del TRIM21 è stato valutato attraverso l’inibizione farmacologica ed esperimenti di silenziamento. Risultati: I topi che hanno ricevuto la combinazione CpG-ODN/anticorpo anti-PD-1 hanno mostrato un aumento della crescita tumorale e una marcata infiltrazione di macrofagi CD206+ e IL-10+ rispetto agli animali trattati con solo CpG-ODN. La deplezione dei macrofagi ha completamente annullato l’aumentata progressione tumorale osservata nel gruppo della combinazione. Gli esperimenti in vitro hanno evidenziato come le cellule RAW264.7 incubate sia con CpG-ODN sia con anticorpo anti-PD-1 esibiscano un profilo di espressione genica completamente differente da quelle trattate con il singolo farmaco, sviluppando un fenotipo caratterizzato dall’up-regolazione di markers associati sia a M1 sia a M2. I saggi multiplex ELISA hanno evidenziato un’aumentata secrezione di citochine relative sia a M1 sia a M2, validando i dati di espressione genica. I saggi funzionali hanno mostrato che i macrofagi stimolati con la combinazione sono in grado di ridurre l’attività citotossica delle cellule NK rispetto ai macrofagi incubati con CpG-ODN o anticorpo anti-PD-1. L’utilizzo di anticorpi anti-PD-1 ingegnerizzati ha rivelato che sia il riconoscimento del dominio Fc sia il sito di legame con l’antigene dell’anticorpo anti-PD-1 sono necessari per determinare I cambiamenti del profilo di espressione genica dei macrofagi osservati nella combinazione. Infine, si è dimostrato che il TRIM21 è coinvolto nelle modificazioni del fenotipo dei macrofagi mediante l’interazione con il dominio Fc dell’anticorpo anti-PD-1. Conclusioni: I risultati di questo studio mostrano che, quando nei macrofagi viene attivato il signaling del TLR9, la co-somministrazione con anticorpo anti-PD-1 induce in queste cellule immunitarie l’acquisizione di un fenotipo misto M1/M2 caratterizzato da funzionalità immunosoppressiva, in grado di compromettere la risposta immunitaria e promuovere la crescita tumorale. Poichè l’associazione di agonisti del TLR9 con anticorpi anti-PD-1 è tuttora investigata in diversi studi clinici, l’impatto di questi agenti faramacologici sui macrofagi dovrebbe essere preso in considerazione per evitare reazioni avverse potenzialmente pericolose, soprattutto nei tumori ad elevata infiltrazione di macrofagi.

Grantor dc:publisher

Università degli Studi di Milano

Year dc:date

2023

Author dc:creator

• INDINO, SERENA LUCIA

Contributors dc:contributor

• tutor: M. Sommariva ; coordinatore: C. Sforza
• S.L. Indino
• SOMMARIVA, MICHELE
• SFORZA, CHIARELLA

• Settore BIO/16 - Anatomia Umana

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess

Language dc:language

eng

Identifier

http://dx.doi.org/10.13130/indino-serena-lucia_phd2023-01-27
10.13130/indino-serena-lucia_phd2023-01-27

OAI identifier oai:identifier

oai:air.unimi.it:2434/949855