PRECLINICAL EVALUATION OF A NOVEL NFIX INHIBITOR FOR MUSCULAR DYSTROPHIES TREATMENT

Le Distrofie Muscolari (DM) sono malattie eterogenee, caratterizzate da progressiva degenerazione muscolare che, nei casi più severi, causa dipendenza dalla sedia a rotelle e morte prematura per blocco respiratorio o disfunzione cardiaca. La migliore strategia terapeutica per le DM coinvolge approcci volti a correggere il difetto genetico, come la terapia cellulare o genica, insieme a terapie secondarie, sviluppate per rallentare il decorso della patologia e preservare la struttura muscolare. In questa prospettiva, nel 2017 è stato dimostrato che l’inibizione del fattore di trascrizione Fattore Nucleare 1 X (Nfix), è in grado di indurre miglioramenti istologici e funzionali in modelli murini di DM, andando a rallentare i cicli di degenerazione/rigenerazione, diminuendo l’infiammazione e la fibrosi e convertendo le miofibre verso un fenotipo più ossidativo e resistente al danno. Inoltre, si è dimostrato che la delezione specifica di Nfix nei macrofagi rallenta la degenerazione muscolare e la formazione di fibrosi, rinforzando il potenziale terapeutico. Considerando che la via di segnalazione MEK/ERK attiva l’espressione di Nfix, recentemente è stata testata l’inibizione farmacologica di Nfix tramite il riposizionamento di inibitori di MEK già approvati dall’FDA per il trattamento oncologico. Questi farmaci hanno diminuito i livelli della proteina di Nfix, ma la non specificità del trattamento ha portato alla comparsa di calcificazioni ectopiche, in parte ridotte dal supplemento nutrizionale con antiossidanti. Per questo, l’identificazione di un inibitore specifico per Nfix è diventata lo scopo centrale di questo progetto di Dottorato. La struttura tridimensionale del dominio di legame al DNA di Nfix (Nfix(DBD)) è stata recentemente risolta, illustrando un nuovo ripiegamento simil-MH1 e caratteristiche centrali per la sua funzione, tra cui un sito di coordinamento per lo Zn2+, assemblamento dimerico e specificità per il legame al DNA. Per identificare molecole capaci di legare Nfix, abbiamo quindi saggiato una libreria di composti fluorurati tramite spettrometria a risonanza magnetica nucleare del fluoro, utilizzando Nfix(DBD) come esca. Tale screening ha identificato ARN2011 come molecola promettente e, dopo la conferma di mancanza di tossicità, abbiamo testato la sua abilità nell’inibire Nfix in diverse tipologie cellulari. Abbiamo valutato l’efficacia di ARN2011 nelle cellule staminali muscolari, ma anche in fibroblasti e macrofagi estratti da muscoli murini, di ratto e umani, in condizioni wild-type e distrofiche. Abbiamo mostrato che ARN2011 è in grado di inibire la regolazione trascrizionale di Nfix ma anche la sua abilità di controllare la fusione dei mioblasti e la conversione dei macrofagi da fenotipo proinfiammatorio a fenotipo antinfiammatorio. Per quanto riguarda la specificità del composto, abbiamo eseguito un’analisi di sequenziamento del RNA estratto da mioblasti wild-type ed Nfix null, trattati e rispettivi controlli, che ha suggerito pochi effetti indesiderati a seguito del trattamento. Inoltre, questi dati hanno fornito nuovi suggerimenti riguardo l’inibizione di Nfix nei mioblasti e il suo ruolo nella proliferazione, nel differenziamento, nel metabolismo e nel segnale cellulare. Parallelamente, abbiamo anche testato ARN2011 in cardiomiociti murini e derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) umane, rivelando l’abilità della molecola di aumentare il battito cardiaco, in linea con quanto dimostrato in un lavoro precedente in cardiomiociti Nfix null. Inoltre, ARN2011 è stato testato su organoidi neuromuscolari derivati da iPS sani e distrofici, confermando la sua capacità di inibire Nfix e migliorare il fenotipo degli organoidi, sia in termini istologici che di abilità contrattili. Abbiamo in seguito saggiato l’azione di ARN2011 in vivo. La prova iniziale è stata eseguita tramite iniezione intramuscolare in modelli murini distrofici, focalizzandoci su analisi metriche e morfologiche, come la deposizione di fibrosi, infiltrati infiammatori e area trasversale delle miofibre. I risultati hanno mostrato l’inibizione di Nfix, seguita da diminuzione di infiammazione e fibrosi, insieme al rallentamento nella rigenerazione muscolare e alla conversione verso un fenotipo lento ed ossidativo. La valutazione dell’azione di ARN2011 tramite somministrazione sistemica è stata poi eseguita sia per via endovenosa che intraperitoneale, ma la corretta posologia rimane ancora da identificare, considerando che i trattamenti preliminari hanno diminuito l’espressione di Nfix in modo randomico in diversi muscoli, indipendentemente dalla via di somministrazione e tempistica di trattamento. In parallelo, lo studio del meccanismo d’azione di ARN2011 è stato eseguito tramite predizioni di legame e mutagenesi sui possibili residui. Le analisi non hanno però confermato l’aminoacido che permette il legame tra il composto e la proteina di Nfix. Infine, per cominciare lo sviluppo farmacologico di ARN2011, 15 analoghi sono stati testati su mioblasti primari murini ed umani, riconoscendo numerose molecole efficaci che hanno permesso la realizzazione del brevetto d’uso per il trattamento delle Distrofie Muscolari. L’inibizione dei fattori di trascrizione (TF) è stata proposta nel 2002 da James Darnell come la strategia terapeutica più diretta. Tuttavia, lo sviluppo di approcci efficaci per contrastare l’attività dei TF si è rivelato complesso, e solo poche piccole molecole hanno mostrato risultati significativi. In questo studio abbiamo dimostrato la possibilità di inibire farmacologicamente un fattore di trascrizione nel muscolo scheletrico: si tratta del primo passo verso lo sviluppo di un inibitore specifico per Nfix, che potrebbe agire in sinergia con terapie correttive già esistenti, aprendo la strada a un trattamento concreto per le Distrofie Muscolari.

Grantor dc:publisher

Università degli Studi di Milano

Year dc:date

2025

Author dc:creator

• EPIS, RAFFAELE

Contributors dc:contributor

• supervisore: G. Messina; coordinatore: S. Ricagno
• R. Epis
• MESSINA, GRAZIELLA
• RICAGNO, STEFANO

• muscular dystrophie
• drug development
• transcription factor
• nuclear factor 1 X
• Settore BIOS-13/A - Istologia ed embriologia umana

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/embargoedAccess
• license:Creative commons
• license uri:http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Language dc:language

eng

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/2434/1198375

OAI identifier oai:identifier

oai:air.unimi.it:2434/1198375