Physical properties of the plasma membrane studied by local probe techniques
Im Rahmen dieser Arbeit wurden physikalische Meßmethoden entwickelt, um die Struktur und Dynamik der Plasmamembran lebender Säugetierzellen zu untersuchen. Dabei lag der Schwerpunkt zum einem auf der mechanischen Kopplung der Membranlipidschicht zu dem darunter liegenden, unterstützend wirkenden Zytoskelett, und zum anderen auf der Beweglichkeit einzelner Membrankomponenten innnerhalb der Membranlipidschicht. Ausgangspunkte für die Entwicklung neuer Methoden waren die Rasterkraftmikroskopie (RKM) und ´single-particle tracking’ (SPT). Die RKMermöglicht die Abbildung von Ober‡ächen mit hoher Au‡ösung in physiologischer Umgebung, so lange die Wechselwirkungskräfte die Probenober‡äche nicht zu sehr deformieren. SPT ist eine Technik, um die Bewegung von einzelnen Molekülen zu verfolgen. Dafür werden diese mit Polysteren-kügelchen oder kolloidem Gold markiert und mit Videomikroskopie beobachtet. Auf diesen Techniken aufbauend wurden folgende Verfahren und Geräte für diese Arbeit entwickelt: Das Scanning-Photonic Force Microscope (SPFM) als Analogon zum RKM: In einer Laserfalle (einem mit einem Objektiv hoher Apperatur (100x, NA 1.3) fokussierten infraroten (IR) Laser) wird ein Fluorophor gefülltes Polysterenkügelchen (bead, r=0.1¹m) gefangen. Die Fluorophore des als Sonde verwendeten Kügelchens werden über einen Zwei-Photonen Prozeß durch den IR-Laser zur Fluoreszenz angeregt. Eine Auslenkung aus der Halteposition durch eine äußere Kraft führt zum Abfall der Fluoreszenz. Im SPFM wird die Sonde mit Hilfe des Lasers analog zum mechanischen Hebelarm im RKM über die Probe bewegt. Dabei wird wie beim RKM die Auslenkung und somit Kraft gemessen. Die wesentlichen Unterschiede sind die fehlende mechanische Verbindung zur Umwelt, die ein Abrastern beliebiger transparenter 3D-Strukturen ermöglicht, die extrem kleine Federkonstante des Sensors (0.1- 1¹N/m), welche daher besser an die Elastiztät von biologischen Objekten angepaßt ist, sowie die stark reduzierte viskose Dämpfung der kleineren Sonde, was schnelleres Messen ermöglicht. Das Photonic Force Microscope (PFM) ist die Weiterentwicklung des SPFM. Bei der verwendeten kleinen Federkonstante werden die thermischen Positions‡ uktuationen sehr groß. Daher wurde ein Detektor entwickelt, der Messung der Position der Sonde in der Falle in drei Dimensionen mit Nanometer Ortsau‡ösung und 50kHz-Bandbreite ermöglicht. Der Detektor basiert auf der Interferenz des an der Sonde vorwärts gestreuten Laserlichts mit dem ungestreuten Licht. Dieses Prinzip wurde zuvor nur für seitliche Auslenkungen entlang einer Achse verwendet und erstmals in dieser Arbeit drei dimensional angewandt. Die vollständige theoretische Beschriebung des Detektorsignals ist ebenfalls ein Novum. Im PFM werden mit diesem Detektor die thermischen 3D-Positions‡uktuationen einer durch den Laser in einem Volumen von 0.1*0.1*0.6¹m3 gehaltenen Sonde analysiert. Zusätzlich wirkende Potentiale und die Viskosität des umgebenden Mediums können gemessen werden.
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