Molekulare, physiologische und biochemische Charakterisierung der Genfamilie für 4-Cumarat:Coenzym A Ligase aus Sojabohne (Glycine max L.)
Die 4-Cumarat:Coenzym A Ligase (4CL) ist ein Enzym des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels, das aktivierte Hydroxyzimtsäure-Ester zur Synthese spezifischer Phenylpropanoide bereitstellt. In vielen Pflanzen kommen strukturell und funktionell sehr ähnliche 4CL-Isoformen vor, weshalb diesem Enzym dort nur eine beschränkte regulatorische Funktion bei der Verteilung der unterschiedlich substituierten Zimtsäurederivate für nachfolgende Synthesen zugesprochen wird. Durch Isolierung der cDNA der von Knobloch und Hahlbrock (1975) partiell gereinigten Ligase 1 und der Vervollständigung der kodierenden Sequenz der Gm4CL4 konnte mit großer Wahrscheinlichkeit die Genfamilie der Sojabohne-4CLs komplettiert werden. Mit der cDNA der Gm4CL1 war außerdem erstmals eine 4CL-Sequenz verfügbar, die für eine Sinapinsäure-umsetzende 4CL kodiert. Zusammen mit den bereits beschriebenen 4CL-Isoenzymen 2 und 3 (Uhlmann und Ebel, 1993; Möllers, 1997) existieren in Sojabohne somit mindestens vier 4CL-Isoformen. Die unterschiedlichen Substratspezifitäten der rekombinanten Proteine, die Fähigkeit, die gesamte Gruppe der pflanzlichen Hxdroxyzimtsäuren zu aktivieren und die differentielle Synthese der Gm4CL-Isoformen nach Elicitor-Behandlung von Sojabohnezellkulturen bzw. Infektion von Sojabohnekeimlingen weisen auf eine bedeutende regulatorische Funktion der 4CL hinsichtlich der Bereitstellung unterschiedlich substituierter Zimtsäurederivate zur Synthese spezifische Phenylpropanoide in Sojabohne hin. Dabei scheinen Gm4CL1 und Gm4CL2 vor allem an der Synthese von Phenylpropanoiden beteiligt zu sein, die für Wachstum und Entwicklung der Pflanzen benötigt werden, während Gm4CL3 und Gm4CL4 aktivierte Zimtsäuren bereitstellen, die aufgrund von Umweltveränderungen benötigt werden. Die 4CL wird mit Acyl-CoA Ligasen, Peptidsynthetasen und Luciferase zur Familie der AMP-bindenden Proteine zusammengefaßt. Diesen Enzymen ist nicht nur der Mechanismus der AMP-Aktivierung gemeinsam, sondern sie besitzen auch Ähnlichkeiten in ihren Proteinstrukturen. Durch Bildung von Hybridenzymen zwischen Gm4CL1 und Gm4CL3 konnte der zentrale Sequenzbereich der 4CL als Substratspezifität-determinierende Region ermittelt werden. Mit Hilfe der Informationen, die von der Kristallstruktur der Phenylalaninaktivierenden Untereinheit der Gramicidin-S-Synthetase gewonnen wurden, konnten vier mögliche Substratbindemotive der 4CL identifiziert werden. Innerhalb eines dieser Motive unterscheidet sich die Gm4CL1 von allen anderen bisher klonierten 4CLs durch den Verlust eines Aminosäurerestes, wodurch die Gm4CL1 in der Lage ist, hochsubstituierte Zimsäurederivate zu aktivieren. Wird der entsprechende Aminosäurerest der Gm4CL2 (Gm4CL2dV345) und Gm4CL3 (Gm4CL3dV367) entfernt, können beide Deletionsmutanten Sinapinsäure umsetzen. Außerdem ist Gm4CL3dV367 in der Lage, 3,4-Dimethoxyzimtsäure zu aktivieren und zeigt eine deutlich erhöhte Affinität gegenüber Ferulasäure. Durch das Entfernen einer einzigen Aminosäure können somit hochsubstituierte Zimtsäurederivate umgesetzt werden. Die Möglichkeit, die Substratspezifität dieses zentralen Enzymes des Phenylpropanstoffwechsels zu modifizieren, eröffnet die Herstellung transgener Pflanzen mit gewünschtem Phenylpropanoid-Profil.
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