Zusammenspiel von posttranskriptionellen Modifikationen und Strukturen von humanen mitochondrialen tRNAs

Zusammenfassung Mitochondrien sind Organellen eukaryotischer Zellen, die für die Energieproduktion der Zellen verantwortlich sind, sowie über ein eigenes Genom verfügen. Das menschliche mitochondriale Genom kodiert 13 Proteine für die Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe und 22 transfer RNAs (tRNAs). Mehr als 80 verschiedene Punktmutationen in den humanen mitochondrialen tRNA Genen werden mit Krankheiten wie Kardiopathie, Enzephalopathie und Myopathien assoziert. Die Bildung von alternativen sekundären und tertiären tRNA-Strukturen könnte die Pathogenität dieser Mutationen erklären. Um Informationen über die strukturelle Dynamik der humanen mitochondrialen tRNAs und über pathogene Mutanten (tRNALys-WT, -A8344G, tRNASer(UCN)-WT, -G7497A, -T7512C, tRNAGln-WT, -T4336C, tRNALeu(CUN)-WT, -A12320G, -G12315A) zu bekommen, wurde die Struktur von in vitro Transkripten mit folgenden Methoden genauer untersucht: chemische und enzymatische Kartierung, UV-Schmelzkurvenanalyse und elektrophoretische Mobilität auf nativen Gelen, sowie posttranskriptionelle Modifikation mit Enzymen aus humanen mitochondrialen Extrakten und aus Saccharomyces cerevisiae (scPus1p und scPus4p). Folgende Ergebnisse wurden dabei gewonnen: enzymatische und chemische Kartierungsdaten und UV-Schmelzkurvenanalyse zeigen, dass die A12320G und G12315A Mutanten der tRNALeu(CUN) eine ungewöhnliche Struktur besitzen, die sich vom Wildtyp deutlich unterscheidet. In humaner mitochondrialer tRNASer(UCN) führt die G7497A Mutation zu einer stark kompaktierten Struktur, was durch temperaturabhängige Strukturanalyse gezeigt wurde. Das durch diese Mutation eingeführte G•U Wobble-Paar im D-Stem hat einen negativen Einfluss auf die Erkennung sowohl durch humane mitochondriale Enzyme, als auch durch Pus4 und Pus1 aus S.cerevisiae. Die strukturelle Dynamik von nicht-modifizierten und teilmodifizierten Transkripten, die mit UV-Schmelzkurven analysiert wurden, zeigt, dass posttranskriptionelle Modifikationen eine wichtige Rolle in der strukturellen und wahrscheinlich auch in der metabolischen Stabilität dieser tRNA spielen. Die Studien der pathogenen G7497A Punktmutation in Osteosarcoma Zellen zeigen, dass untermodifizierte tRNAs instabil sind und in der Zelle schnell abgebaut werden. Es wurde eine Reduktion zur Verfügung stehender funktioneller tRNAs in Mitochondrien auf 10 % gefunden, was zu einer Verminderung der Proteinsynthese um 40 % führt [Mollers et al., 2005]. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die meisten pathogenen Mutationen im Kernbereich der tRNA deren Struktur signifikant beeinflussen. Mit Ausnahme einer Mutation T4336C in tRNAGln, welche die Aktivität von Pseudouridin-Synthase im Vergleich zu dem Wildtyp erhöhte, zeigten die meisten pathogenen Mutationen eine Verringerung der Aktivität von den Modifikationsenzymen.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2007

Author dc:creator

• Hayrapetyan, Armine

Contributors dc:contributor

• Jäschke, Andres

Repository record source_url

http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/7340

OAI identifier oai:identifier

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