Molecular characterization of the Drosophila mitotic inhibitor Frühstart
Das Ziel dieser Arbeit war die biochemische, molekulare und genetische Charakterisierung des Drosophila Gens frühstart. In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, daß Frs als mitotischer Inhibitor wirkt, der spezifisch der Funktion der Protein-Phosphatase String entgegenwirkt, dadurch die Mitosen in den Zellen der Ventralfurche verzögert und so diesen Zellen erlaubt, die für die Ventralfurchenbildung erforderlichen morphogenetischen Prozesse ohne Störungen durch mitotische Zellteilungen zu durchlaufen. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß frs ausreichend und zum Teil notwendig ist, um die schnellen syncytialen Kernteilungen nach der 13. Teilung und während der nachfolgenden Zellularisierung auszusetzen. Die vorliegende Arbeit beschreibt verschiedene weitergehende und bisher unbekannte physiologische und biochemische Eigenschaften von Frs. So wird gezeigt, daß durch die ektopische Expression von Frs in späteren embryonalen Entwicklungsstadien auch der reguläre Zellzyklus inhibiert werden kann, diese Inhibition durch Blockierung der M-Phase verursacht wird und der damit verbundene direkte Übergang von der G2 zur G1 Phase zu Endoreplikationen in den betroffenen Zellen führt. Dieser durch Frs-Überexpression verursachte Phänotyp ist konsistent mit den Phänotypen von Cdk1 und CycA Mutanten. Um eine molekulare Verbindung zwischen Cdk1 und Frs herstellen zu können, wurde in dieser Arbeit nach mit Frs interagierenden Faktoren gesucht, deren Interaktionen mit Hilfe vielfältiger biochemischer Methoden analysiert wurden. Frs interagiert hauptsächlich mit zwei verschiedenen Arten von Proteinen: Nukleoporinen und Cyclinen. Durch molekulare in vitro Analyse konnte gezeigt werden, daß die Aminosäuresequenz von Frs neben einer Leuzinreichen Region (putatives NES), die für die Bildung des Frs-Nup50-Komplexes notwendig ist, zwei Haupt-Phosphorylierungsstellen (T22 and T48) und ein KxL-Motiv enthält, das essentiell für die direkte Interaktion von Frs mit dem hydrophoben Patch von Cyclinen ist. Die physiologische Funktion dieser Motive wurde in Rescue-Experimenten überprüft. So konnte gezeigt werden, daß das KxL-Motiv essentiell für die Frs-Funktion im Embryo ist. Die beiden Phosphorylierungsstellen tragen in vivo teilweise, das putative NES-Motiv hingegen überhaupt nicht zur antimitotischen Aktivität von Frs bei. Mit Hilfe von surface-plasmon-resonance-Analyse wurde zudem gezeigt, daß Frs bevorzugt an mitotische Cycline bindet und eine viel höhere Affinität für das mitotische Cyclin A als für das G1/S spezifische Cyclin E aufweist. Mit der gleichen Methode konnte keinerlei Interaktion von Frs mit der Cdk-Untereinheit nachgewiesen werden. Somit unterscheidet sich das Bindungsverhalten von Frs von dem bereits bekannter Mitglieder der Cyklin-abhängigen Kinase-Inhibitor-Familien INK4 und CIP/KIP, was darauf schließen läßt, daß die Funktion von Frs auf einem neuen Mechanismus der Cdk-Inhibierung basiert. Zusammenfassend bleibt festzustellen, daß die Bindung von Frs an den hydrophoben Patch ausreichend ist, um den Eintritt in Mitose 14 zu inhibieren und das der hydrophobe Patch somit eine wichtige Rolle in der Zellzyklusregulation während des Drosophila- Midblastula-Übergangs spielt.
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