Untersuchungen zum differentiellen Transport der alpha1- und alpha2-Untereinheiten des GABA-A-Rezeptors und zur TNT-vermittelten interzellulären Kommunikation zwischen Astrozyten und Neuronen
GABAA-Rezeptoren sind pentamere Neurotransmitterrezeptoren, die in ihrer Untereinheitenzusammensetzung stark variieren können. Verschiedene Rezeptor-Subtypen zeigen dabei eine differentielle Verteilung an der somato-dendritischen Membran hippokampaler Neurone. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der differentielle Transport der Untereinheiten alpha1 und alpha2 des GABAA-Rezeptors in hippokampalen Neuronen untersucht. Hierzu wurden die Untereinheiten entweder C- oder N-terminal mit GFP-Varianten mit unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften markiert, um eine simultane mikroskopische Untersuchung in vivo zu ermöglichen. Mit Hilfe sensitiver Oberflächenimmunfluoreszenzfärbungen sowie über die GFP-Fluoreszenz der Fusionsproteine konnten die Rezeptorchimären sowohl in kultivierten Zelllinien, als auch in hippokampalen Neuronen an der Plasmamembran detektiert werden - ein Hinweis auf ihren effizienten Transport. Mittels Saccharose-Dichte-Gradienten-Zentrifugation konnte zudem gezeigt werden, dass die Fusionsproteine in Gegenwart der Untereinheiten beta2 und gamma2 zu pentameren Rezeptoren oligomerisieren können. Elektrophysiologische Analysen der Rezeptorchimären zeigten, dass diese funktionelle, GABA-sensitive Chlorid-Kanäle ausbilden können. Die als funktionell charakterisierten Fusionsproteine wurden anschließend für mikroskopische in vivo Transportstudien in kultivierten, hippokampalen Neuronen verwendet. Diese Studien zeigten, dass alpha1- und alpha2-Rezeptorchimären an unterschiedlichen Bereichen der Plasmamembran „Cluster“ bilden. Während die „Cluster“ von alpha1-Rezeptor-Subtypen homogen verteilt, sowohl am Zellsoma, als auch an den Dendriten detektiert werden konnten, waren die „Cluster“ von alpha2-Rezeptor-Subtypen hauptsächlich im Bereich des Zellsomas zu finden. Neben der räumlich differentiellen Verteilung beider Untereinheiten, konnte auch eine vom Differenzierungsgrad der kultivierten Neurone abhängige Bildung von „Clustern“ beobachtet werden. Erste „Cluster“ der alpha1-Rezeptor-Subtypen waren bereits nach 5 Tagen zu erkennen, während „Cluster“ von alpha2-Rezeptor-Subtypen erst nach 8 Tagen nachweisbar waren. Mit Hilfe der generierten Fusionsproteine konnten in hippokampalen Neuronen neben „Rezeptorclustern“ auch Strukturen beobachtet werden, die aufgrund ihrer Bewegungseigenschaften auf Transportvesikel hindeuten. Diese wiesen im Gegensatz zu den immobilen „Clustern“ eine deutlich höhere Mobilität auf. Während den Untersuchungen zum GABAA-Rezeptor-Transport konnte beobachtet werden, dass hippokampale Neurone und in der Kultur verbliebene Astrozyten durch „tunneling nanotubes“ (TNTs) verbunden waren. Aus diesem Grund wurde ein weiteres Augenmerk auf den TNT-vermittelten, interzellulären Transfer membranöser Strukturen zwischen kultivierten Astrozyten und Neuronen gelegt. Dabei gelang es, den Austausch von kleinen Membranstrukturen zwischen den Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Durch Applikation von Zytoskelettgiften konnten Hinweise auf einen F-Aktin-basierten Transfer der übertragenen Strukturen gefunden werden, wenngleich ein endgültiger Beweis für eine Beteiligung von TNTs so nicht zu erbringen war. Um den beobachteten Membrantransfer mit der Existenz von TNT-Strukturen zu korrelieren, wurde deshalb ein spezielles Zellkultivierungssystem - basierend auf mikrostrukturierten Oberflächen - entwickelt. Dieses System erleichterte die Visualisierung von TNT-ähnlichen Strukturen in den Kulturen dramatisch und könnte somit zukünftig eine Korrelation zwischen dem Auftreten von TNT-ähnlichen Strukturen und dem beobachteten Vesikeltransfer ermöglichen.
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