Schlussleisten (Zonulae occludentes) und biochemisch verwandte Strukturen: Tight Junction-Proteine und -Funktionen in mehrschichtigen Epithelien, mit besonderer Berücksichtigung der Plattenepithelmetaplasie
In vielzelligen Organismen bilden Epithelien an der Körperoberfläche und als Auskleidung der inneren Lumina funktionelle Grenzschichten, die sowohl das Körperinnere von der äußeren Umwelt und die Fortsetzung der Körperoberfläche, d.h. die Lumina der Organe trennen als auch das Körperinnere in verschiedene Kompartimente unterteilen. Dabei sind die Epithelzellen jeweils in charakteristischer Weise durch verschiedene Zell-Zell-Verbindungen zu einem bestimmten Epithelgewebe gekoppelt. Die „Tight Junctions“ (TJ) sind dabei für die Herstellung und Aufrechterhaltung der unterschiedlichen molekularen Zusammensetzungen der einzelnen Kompartimente, vor allem als Haupt-Barriere für die parazelluläre Ausbreitung von Zellen, Partikeln und vielen Molekülarten, besonders wichtig. Während die Zell-Zell-Verbindungen der TJ seit den 1960er Jahren in einschichtigen polaren Epithelien sowohl strukturell als auch funktionell eingehend untersucht worden sind, galt bis zur Jahrtausendwende noch die überwiegende Ansicht in der Fachliteratur – auch als Lehrbuchdogma -, dass TJ oder äquivalente Strukturen in mehrschichtigen Epithelien nicht vorkommen und hier andere Strukturen, nämlich interzelluläre Lipid-Akkumulationen, für die Bildung und Aufrechterhaltung der Barriere-Funktion verantwortlich sind. Nachdem in den letzten Jahren jedoch TJ-Proteine sowie TJ-artige Strukturen und Funktionen in einigen mehrschichtigen Epithelien und davon abgeleiteten Geweben (Hassall-korpuskel und Tumoren) nachgewiesen worden sind, sollte in der vorliegenden Dissertation geklärt werden, welche TJ-Proteine in bestimmten TJ-Strukturen oder in sog. „TJ-verwandten“ Anordnungen in mehrschichtigen Epithelien von Säugetieren vorkommen. Außerdem sollte geklärt werden, ob und wie pathologische mehrschichtige Epithel-Bildungen wie sog. Plattenepithel-Metaplasien oder bestimmte Strukturen in Plattenepithel-karzinomen typische TJ-Proteine enthalten können. Bei diesen Untersuchungen konnten zunächst kleine, punkt- oder zapfenförmig erscheinende TJ-artige Membran-Kontaktstellen als häufige interdesmosomale Strukturen nachgewiesen werden: Mit Hilfe der Gefrierbruchtechnik ließen sich elektronenmikroskopisch in der Membranspaltebene zwischen den Desmosomen diese kleinen Strukturelemente als säulenstumpfartige Erhebungen von bis zu ca. 12 nm Durchmesser darstellen, die an manchen Stellen auch zu linearen, z.T. gewundenen und verzweigten Reliefbändern fusioniert erschienen. Zumindest in bestimmten Plattenepithelien entsprachen die Positionen dieser interdesmosomalen Membran-Kontakte in licht- wie in elektronenmikroskopischen Immunlokalisierungsexperimenten Stellen, an denen typische TJ-Proteine wie z.B. Occludin oder bestimmte Claudine angereichert waren. Diese neuartigen TJ-Protein-Strukturen wurden daher als „Stud Junctions“ (Puncta occludentia) bezeichnet und mit anderen TJ-verwandten, Claudin- bzw. Occludin-haltigen interdesmosomalen Strukturen wie den „Lamellated Junctions“ oder den „Sandwich Junctions“ einiger Plattenepithelien verglichen. Zur möglichen molekularen Struktur und zur Bedeutung dieser „Stud Junctions“ werden Hypothesen vorgestellt. Weiterhin konnten TJ-Proteine und sowohl typische TJ- als auch TJ-verwandte Strukturen in metaplastisch verändertem Bronchialepithel in situ und in vermeintlich mehrschichtigen Zellkultur-Modellen der Plattenepithelmetaplasie nachgewiesen werden, wobei z.T. auch die jeweilige Fähigkeit, eine Barriere-Funktion in der Kulturschale auszuüben, untersucht wurde. Durch biochemische und immunologische Analysen ließen sich dabei TJ-Proteine wie Claudin-1, Claudin-4 und Claudin-7 nachweisen, vielfach zusammen mit Occludin bzw. Protein ZO-1. Elektrophysiologische Messungen ergaben aber, dass in sog. „Monolayer“-Kulturen von aus Bronchialepithelien abgeleiteten Zellen diese TJ-artigen Gebilde für die Barriere-Funktion allenfalls nur eine sehr geringe Bedeutung haben können. Denn im Vergleich mit der von einem Kolonkarzinom abgeleiteten, polaren Epithelzell-Linie CaCo-2 wiesen die polaren bronchialepithelialen Zellen der Linien 16HBE und CaLu-3 recht niedrige - und die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht induzierten Metaplasie-Modelle („Multilayer“-Kulturen) sogar nur äußerst geringe - Widerstandswerte auf, deren Signifikanz überdies noch zweifelhaft blieb. Biochemische Befunde, vor allem bei Immunpräzipitationsexperimenten, legten außerdem den Schluss nahe, dass bei diesen bronchialepithelialen Zellkulturen 1 Zusammenfassung Claudin-1 mit Claudin-7 und dem ebenfalls vorkommenden Claudin-4 Komplexe bilden kann. Dagegen wurden bei CaCo-2 Zellen ausschließlich Interaktionen von Claudin-1 mit Claudin-7 nachgewiesen. Zusätzlich konnten TJ-Proteine (z.B. Occludin, Claudin-1, Claudin-4, Claudin-7, Protein ZO-1, Cingulin) und zum Teil auch TJ-artige Strukturen in bestimmten Bereichen unterschiedlich differenzierter Plattenepithelkarzinome - auch der Lunge - und in Plattenepithelmetaplasien in situ sowie in den entsprechenden Zellkulturmodellen erkannt werden. Auch das erst jüngst entdeckte TJ-Transmembranprotein Tricellulin konnte an den jeweiligen Kontaktstellen von drei Zellen nicht nur in einschichtigen Epithelien und davon abgeleiteten Zellkulturlinien lokalisiert werden, sondern auch an den entsprechenden Stellen in der obersten Schicht von Kulturen mehrschichtiger Keratinocyten der menschlichen HaCaT-Linie. Ein Nachweis von Tricellulin-haltigen Kontakten in mehrschichtigen Epithelien in situ scheiterte allerdings bisher daran, dass im Menschen – mindstens - zwei Spleißformen des Tricellulin-Gens vorkommen, aber für die hier wohl relevante zweite Spleißvariante bisher noch kein spezifischer Antikörper zur Verfügung stand. Die Barriere- bzw. Selektions-Funktion der TJ-Strukturen in mehrschichtigen Epithelien und entsprechenden Zellkultur-Modellen konnte auch mit Hilfe wasserlöslicher Nachweismittel (Tracer) wie z.B. LaCl3 oder mit Dextran-Partikeln verschiedener Größe elektronen-mikroskopisch bzw. in physiologischen Translokationsexperimenten bestätigt werden. Die Befunde werden auch im Zusammenhang mit der Hypothese einer extrazellulären „Lipid-Barriere“ diskutiert bzw. als Bestätigung der Vorstellung, dass es in vielen, vielleicht allen Plattenepithelien zwei verschiedene Barriere-Systeme für parazelluläre Molekülverteilungen gibt, die beide essentiell, aber auch komplementär sind, d.h. dass es sowohl ein TJ-System als auch eine Absperrung durch interzelluläre lipidreiche Dichtungen gibt. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen also, dass es in mehrschichtigen Epithelien generell TJ-Proteine in verschiedenen TJ-artigen Struktursystemen, aber auch in weiteren, bisher noch nicht hinreichend erforschten „Junction“-Strukturen gibt, wobei in jedem Fall mindestens ein komplettes „Abschluss-System“ in den obersten lebenden Zellschichten vorkommt und wohl essentiell ist. Von den zusätzlichen TJ-Protein-haltigen Strukturen ist das in dieser Arbeit definierte interdesmosomale Punctum occludens das räumlich kleinste, durch seine Häufigkeit aber sicherlich auch bemerkenswerteste Strukturelement, das es nun in zukünftigen Experimenten in seiner Funktion und möglichen Beteiligung beim Aufbau größerer TJ-Strukturen aufzuklären gilt. Während die Bronchial-Plattenepithel-Metaplasie in situ einem ähnlichen geordneten Aufbau wie andere Plattenepithelien aufweist, stellen die mehrschichtig erscheinenden Zellkultur-Systeme bronchialepithelialer Herkunft kein Kultur-Modell einer Metaplasie, sondern eine Zellkultur-Struktur sui generis dar, bei der TJ-artige Molekülanordnungen in praktisch allen Zellschichten vorkommen. Die Bedeutung dieser Befunde für einige Funktionen solcher Epithelien, bestimmter krankhafter Entartungen (Plattenepithelmetaplasien) und in der zukunftigen Tumordiagnostik wird diskutiert.
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