Identifizierung und Charakterisierung einer Protein-Protein-Interaktion beim Morbus Parkinson
In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion der proteasomalen Untereinheit alpha4 mit Parkin untersucht. Frühere Untersuchungen in einem Yeast-Two-Hybrid-Screen mit einer humanen fötalen cDNA-Hirn-Bibliothek hatten Hinweise auf eine solche Wechselwirkung ergeben. Um die Bindung zwischen Parkin und der alpha4-Untereinheit zu verifizieren, und um erste Hinweise auf die mögliche Bindungsdomäne in Parkin zu erhalten, wurde ein weiterer Yeast-Two-Hybrid-Assay mit verschiedenen Parkin-Konstrukten, inklusive mutierten Proteinen von Parkin, durchgeführt. Dieser Assay bestätigte die Interaktion zwischen Parkin und alpha4, konnte jedoch keine Hinweise auf die Bindungsdomäne liefern, da sämtliche C-terminalen Konstrukte in einem Vortest (Reporteraktivitätsassay) als autoaktivierend reagierten und somit nicht bei der anschließenden Interaktions Mapping-Analyse eingesetzt werden konnten. Als weitere Bindungsstudien wurden Co-Lokalisationsstudien, Co-Immunpräzipitationen. Pull Down-Experimente und Gelfiltrationen durchgeführt. Die Ergebnisse der übrigen Versuche ließen folgende Rückschlüsse bezüglich der Interaktion zwischen der alpha4-Untereinheit des 26S Proteasoms und Parkin zu: Zum einen konnte anhand der Ergebnisse ein Bindungsbereich eingegrenzt werden. Eine Bindung von alpha4 mit dem amino-terminalen Bereich von Parkin (Aminosäuren 1-191) kann ausgeschlossen werden. Dagegen wurde aber immer mit einem der carboxy-terminalen Fragmente von Parkin (Aminosäuren 192-465) eine Interaktion mit der alpha4-Untereinheit nachgewiesen. Dies lässt darauf schließen, dass die Bindungsdomäne in diesem carboxy-terminalen Bereich von Parkin liegt. Zum anderen zeigten die Ergebnisse, dass weder die Mutation in der Ring 1-Domäne (Mutante C289) noch in der Ring 2-Domäne (Mutante C418R) die Interaktion aufzuheben vermag. Die Ergebnisse der verschiedenen Experimente für die einzelnen Parkin-Konstrukte waren teilweise unterschiedlich. Daher ist anzunehmen, dass sie Interaktion sehr schwach und/oder transient ist. Die Interaktion von alpha4 mit Parkin ist ein bisher unbekanntes Phänomen, da bisher nur Interaktionen bekannt waren, bei denen Parkin mit Untereinheiten der 19S-Komplexe (Rpn10, Rpt6, Rpn1 oder Rpn2) des 26S Proteasoms interagiert. Die Untereinheit alpha4 gehört aber zu den Untereinheiten des 20S-Kernkompexes des 26S Proteasoms. Im Unterschied zu den Interaktionen mit Untereinheiten des 19S Komplexes, erfolgt hier die Bindung nicht am N-Terminus von Parkin, sondern an seinem C-Terminus. Zudem ist alpha4 kein Substrat für die Parkin-abhängige Ubiquitylierung. Demzufolge könnten mögliche Funktionen dieser Interaktion Substrat-Präsentation an das 26S Proteasom sein, oder Regulierung der proteasomalen Aktivität.
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