Regulation of taproot development and sucrose stabilization in sugar beet: Influence of invertase inhibitors and occurrence of mitochondrial energy-dissipating proteins
Die Zuckerrübe (Beta vulgaris) ist eine der wenigen Pflanzen, die große Mengen Saccharose speichert. Während der Entwicklung der Speicherwurzel akkumuliert Saccharose in den Vakuolen und kann in modernen Sorten einen Anteil von bis zu 20 % des Frischgewichtes erreichen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression der wichtigsten Saccharose-spaltenden Enzyme bestimmt. Die Aktivität von Invertasen zeigt eine negative Korrelation zur Saccharoseanreicherung und während des Großteils der Speicherwurzelentwicklung werden lediglich Isoformen der Saccharose-Synthase und keine Invertasen exprimiert. Nach Verwundung werden eine Zellwand-lokalisierte und eine vakuolären Invertase induziert, wobei letztere für einen großen Teil der Saccharoseverluste nach der Ernte verantwortlich ist. Versuche die Aktivität dieser vakuolären Invertase durch Überexpression eines Invertaseinhibitors aus Tabak zu unterbinden erbrachten keine Verringerung der wundinduzierten Saccharosehydrolyse. Ein endogener Invertaseinhibitor der Zuckerrübe, BvC/VIF1 (Beta vulgaris cell wall or vacuolar inhibitor of beta-fructosidase), wurde identifiziert und funktionell charakterisiert. Der Inhibitor zeigt eine starke Expression während der Speicherrübenentwicklung und das rekombinant hergestellte BvC/VIF1-Protein zeigt eine hohe Affinität zu sauren Invertasen, insbesondere zu vakuolären Invertasen. Um mehr über die physiologische Rolle des Inhibitors während der Entwicklung der Zuckerrübenspeicherwurzel herauszufinden, wurde Versuche zur Verringerung der Expression dieses Gens unternommen. Außerdem wurden Zuckerrübenpflanzen hergestellt, die BvC/VIF1 vermehrt exprimieren. Erste Untersuchungen an diesen Pflanzen zeigten, dass es hierdurch zu einer signifikanten Verringerung der vakuolären Invertaseaktivität in Blättern kommt. Mittels eines gegen das BvC/VIF1-Protein erstelltem Antiserums wurden zwei Inhibitorproteine in Speicherwurzelextrakten nachgewiesen. Dahingegen trat in der Zellwand von Beta vulgaris Suspensionskulturzellen nur ein Protein auf. Von diesen drei Proteinen wurden partielle Peptidsequenzen ermittelt, die mit der bekannten BvC/VIF1-Sequenz übereinstimmten. In Blättern von transgenen, BvC/VIF1 überexprimierenden, Pflanzen wurden zwei Proteine beobachtet, die eine ähnliche Größe zeigen wie die in untransformierten Speicherwurzeln beobachteten und die in Blättern von Wildtyppflanzen nicht vorhanden sind. Dies deutet daraufhin, dass möglicherweise Proteine mit unterschiedlichen Größen durch die Translation eines einzelnen BvC/VIF1-Gens entstehen. Die subzelluläre Lokalisierung der Inhibitorproteine wurde mittels GFP-Fusionen analysiert. Die Fusionsproteine wurden entweder in der Vakuole beobachtet, was auf das Vorhandensein von vakuolären Sortierungssignalen hindeutet, oder aggregierten in Vesikel-artigen Strukturen. Weiterhin trat eine proteolytische Spaltung von Inhibitor-GFP Fusionen auf, die zum Nachweis von freiem Inhibitorprotein führte. Mittels differentieller Extraktion aus untransformierten Speicherwurzeln und Suspensionskulturzellen konnte gezeigt werden, dass das kleinere der beiden Inhibitorproteine in der Zellwand lokalisiert zu sein scheint. Um die Wechselwirkung zwischen Invertase und Inhibitor genauer zu untersuchen, wurde eine Zuckerrüben-Invertase rekombinant in Bakterien hergestellt und ihre enzymatischen Eigenschaften untersucht. Der Km-Wert der Invertase liegt im unteren millimolaren Bereich und das Enzym zeigt eine maximale Aktivität zwischen pH 4 und 6. Die Wechselwirkung mit dem Invertaseinhibitor ist ebenfalls in hohem Maße pH-abhängig und zeigt ein Maximum zwischen pH 4 und 5. Oberhalb von pH 6 kommt es zu keiner Bindung des Inhibitors an die Invertase. Da die pH-Bedingungen von zellulären Kompartimenten wie der Zellwand oder der Vakuole dynamischen Schwankungen unterliegen, handelt es sich hierbei möglicherweise um einen Regulationsmechanismus der Invertaseinaktivierung. In einem zweiten Projekt wurden erste Ergebnisse über das Vorhandensein und die Regulation von Proteinen, die die Effizienz der Atmung regulieren erzielt. Zwei Isoformen von sogenannten Uncoupling Proteinen werden konstitutiv in der Zuckerrübe exprimiert, während eine Induktion einer alternativen Oxidase nach Verwundung und Lagerung beobachtet wurde. Mitglieder beider Genfamilien sind mögliche Zielgene, die Saccharoseverluste während der Lagerung beeinflussen können. Sie dienen als Energie-Ableitungssysteme und ihre Aktivität kann die Respiration erhöhen, was einen vermehrten Saccharoseabbau zur Folge hat. Die ermittelten Ergebnisse weisen daraufhin, dass zumindest die alternative Oxidase eine starke Reaktion auf Verwundung und Lagerung zeigt.
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