Funktionelle Charakterisierung von TRAP-Invasinen in Plasmodium und Identifizierung eines potentiellen Invasins in Merozoiten
Plasmodium-Parasiten durchlaufen einen komplexen Lebenszyklus in zwei Wirten und müssen jeweils spezifisch verschiedene Zelltypen invadieren. In Sporozoiten und Ookineten konnten Mitglieder der TRAP-Familie als Invasine charakterisiert werden. Im Gegensatz dazu ist das Protein, das den Eintritt der Merozoiten in die Erythrozyten vermittelt, noch nicht bekannt. Die Merozoiten-Invasion verläuft in mehreren Schritten, die aus einer reversiblen Adhäsion, einer Re-Orientierung des apikalen Pols, einer irreversiblen Adhäsion begleitend mit der Ausbildung einer elektronen-dichten Verbindung (tight junction) und dem Eintritt der Parasiten in die Wirtszelle bestehen. Es konnten zwar Proteine des Parasiten identifiziert werden, die bei der Erythrozyten-Invasion beteiligt sind, jedoch ist deren direkte Funktion bei der aktiven Invasion weitgehend ungeklärt. Proteine der TRAP-Familie übertragen eine extrazelluläre Bindung an ein Substrat oder Rezeptor an die Motormaschinerie des Parasiten, wodurch dieser aktiv in die Wirtszelle eindringen kann. Datenbankanalysen zeigten, dass im Genom von P. falciparum ein weiteres Protein zu finden ist, das die charakteristischen, strukturellen Merkmale von Invasinen der TRAP-Familie aufweist. Dieses Protein, TLP1 (TRAP-like protein 1), besitzt extrazellulär zwei von Willebrand A-Domänen die durch einen TSR (thrombospondin typeI repeat) voneinander getrennt werden, eine Transmembrandomäne und eine kurze zytoplasmatische Domäne, die durch eine Ansammlung negativer Aminosäure-Reste und ein konserviertes C-terminales Tryptophan gekennzeichnet ist. TLP1 ist in den Blutstadien exprimiert und ist während des asexuellen Wachstums in späten Schizonten angereichert. Ein charakteristisches Merkmal ist eine stadien-spezifisch essentielle Funktion der TRAP-Proteine. Dies trifft auch für TLP1 zu. Mit Hilfe der reversen Genetik konnte gezeigt werden, dass TLP1 für die Blutstadien-Entwicklung des Parasiten notwendig ist. Die zytoplasmatische Domäne (CTD) von Invasinen der TRAP-Familie wird durch Aldolase-Tetramere mit dem Aktin-Myosin-Motor verbunden. Mit Hilfe von in vitro-Bindungsstudien konnten wir zeigen, dass auch die Carboxy-terminale Domäne von TLP1 mit Aldolase interagiert. Ein wichtiger funktioneller Test für eine direkte Funktion in der Invasion sind in vivo-Komplementations-Studien, in denen gezeigt wird, ob die essentielle Funktion der zytoplasmatischen Domäne von TRAP durch orthologe Regionen von Kandidaten-Proteinen ersetzt werden kann. Die zytoplasmatischen Domänen von TLP1 und von CTRP, dem beschriebenen Ookineten-Invasin, können die TRAP-CTD-Mutante partiell retten. Mit diesem Ansatz konnte desweiteren EBA175, das in der Literatur als TRAP-Paralog in Blutstadien postuliert wurde, ausgeschlossen werden. Zusätzlich konnte MTI-1, ein weiteres in der Datenbank identifiziertes TRAP-ähnliches Protein, durch diese funktionelle Charakterisierung von dieser Invasin-Familie getrennt werden. TLP1 erfüllt somit die Kriterien eines Invasins der TRAP-Familie in Blutstadien. Zusammen mit weiteren Merozoiten-Oberflächenproteinen könnte TLP1 die Translokation der Verbindung zwischen Parasiten- und Wirtszellmembran (tight junction) ausführen und somit die Invasion der Merozoiten in Erythrozyten vermitteln.
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