Funktionelle Charakterisierung und ultrastrukturelle Lokalisierung der Isotypen des Hüllprotein-Komplexes Coatomer
Ausgangspunkt der Doktorarbeit war die funktionelle Charakterisierung von 1- und 2-COP im sekretorischen Weg. Dazu wurden Unterschiede von 1- und 2-COP hinsichtlich verschiedener Interaktionspartner und ihrer Lokalisierung entdeckt. Es wurden Bindungsstudien mit den g1- und g2-COP appendage Domänen durchgeführt. Appendage Domänen wurden erstmalig bei den a/b-Adaptinen, Bestandteile der Clathrin-Adaptorkomplexe (APs), identifiziert. Neben Aminosäuresequenz-Vergleichen zwischen AP-Komplexen und dem b/d/g/z-COPI Subkomplex (Schledzewski et al. 1999), der unter nicht physiologischen Salz-Bedingungen vom a/b’/e-COPI Subkomplex dissoziiert werden kann, legte die Strukturaufklärung der g1-COP appendage Domäne (Hoffman et al. 2003; Watson et al. 2004) eine Analogie zwischen COPI- und Clathrin-vermitteltem Transport nahe. Während eine Vielzahl von appendage-Bindern im Clathrin-System beschrieben sind (Praefcke et al. 2004), waren im COPI-System ausschließlich ArfGAP2 und ArfGAP3 als g1-COP-Binder bekannt (Watson et al. 2004). In dieser Arbeit konnten ArfGAP1, ArfGAP3 und Annexin A11 als präferentielle g2-COP- und Zfp289 als g1-COP- Bindepartner identifiziert werden. Zfp289 ist als Protein mit Arf1-GAP Aktivität beschrieben worden (Singh et al. 2001) und ist möglicherweise identisch mit ArfGAP2. Während eine Beteiligung der kleinen GTPase Arf1 und deren ArfGAPs an der COPI-Biogenese unstrittig ist (Palmer et al. 1993), ist der Einfluß von Annexin A11 gegenwärtig unverstanden. Eine Beteiligung von Ca2+ sowohl bei dem COPI-vermittelten Transport (Chen et al. 2002) als auch an der Rekrutierung von Annexin A11 an Membranen (Lecona et al. 2003) legt dieser Interaktion zumindest eine funktionelle Relevanz nahe. Weiter konnten g1z2- und g2z1-COP enthaltende COPI-Vesikel immunisoliert werden. Unterstützt wird die Präsenz von diesen distinkten Vesikeln durch eine Analyse der ultrastrukturellen Lokalisierung von g1-, g2- und z2-COP: Während g1- und z2-COP präferentiell im cis-Golgi lokalisierten, wies g2-COP eine trans-Golgi Lokalisation auf. Dies legt eine Funktion von g1z2-Coatomer im cis- und von g2z1-Coatomer im trans-Golgi Bereich nahe. Wie auch im Clathrin-System wird daher beim COPI-vermittelten Transport Heterogenität durch Variation der Hüllproteine erlangt. Ferner könnten die den AP Komplexen entsprechenden Komponenten von Coatomer, g1- und g2- bzw. z1- und z2-COP, eine Direktionalität des Transports determinieren. Letztlich konnten zwei Zelllinien etabliert werden, die einen induzierbaren, individuellen g1- oder g2-COP knock-down erlaubten. Der knock-down der einzelnen g-COP Isoformen konnte, wie auch ein RNAi-basierter knock-down beider Isoformen gleichzeitig, nur transient erreicht werden. Dies unterstützt eine essentielle und unterschiedliche Beteiligung von g1- und g2-COP am sekretorischen Weg.
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