Molecular Analysis of the Unconventional Export Machinery of Galectin-1, a beta-Galactoside-specific Lectin of the Extracellular Matrix
Galectin-1 ist ein β-Galaktosid-spezifisches Lektin der extrazellulären Matrix, das an der Regulation verschiedener zellulärer Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt ist. Das extrazelluläre Auftreten von Galectin-1 war zunächst eine überraschende Entdeckung, da das Protein kein Signalpeptid enthält und somit nicht über ER/Golgi-vermittelten Transport sezerniert werden kann. Darüber hinaus ist die Sekretion von Galectin-1 in Gegenwart von Brefeldin A nicht gehemmt, so dass ein unkonventioneller Sekretionsweg postuliert wurde. In der vorliegenden Dissertation wurde ein robustes in vivo Modell zur funk¬tionellen Rekonstitution der Galectin-1 Sekretion etabliert. Es wurden mittels retroviraler Transduktion stabile Zelllinien generiert, die verschiedene Galectin-1 Reportermoleküle als GFP Fusionsproteine in Abhängigkeit von der exogenen Zugabe von Doxicyclin exprimieren. Da die exportierte Population über β-Galaktosid-haltige Rezeptoren an Zelloberflächen bindet, konnte die Galectin-1 Sekretionsrate über verschiedene Methoden wie Durchflusszytometrie, konfokale Laserscanmikroskopie sowie biochemische Zelloberflächenbiotinylierung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen quantifiziert werden. Die etablierten Modellsysteme wurden einerseits zur funktionellen Charakteri¬sierung eines in dieser Arbeit identifizierten Galectin-1 Rezeptors genutzt und andererseits zur Analyse der molekularen Sortierungsdeterminanten verwendet, die Galectin-1 zur entsprechenden Exportmaschinerie dirigieren. Eine systema¬tische Mutagenese des offenen Leserasters von Galectin-1 ergab hierbei, dass Mutationen, die zu einer Bindungsdefizienz führen, letztlich auch einen Exportdefekt verursachen. Komplementär hierzu konnte gezeigt werden, dass Galectin-1 von Zelllinien, die nicht zur Expression von β-Galaktosid-haltigen Rezeptoren befähigt sind, nicht exportiert wird. Hieraus wurde der Schluss gezogen, dass β-Galaktosid-haltige Zelloberflächenrezeptoren für den Gesamtprozess der Galectin-1 Sekretion essentiell sind. Dieser Befund konnte durch die Expression des mit Galectin-1 entfernt verwandten Proteins CGL-2 aus dem multizellulären Pilz Coprinopsis cinerea bestätigt werden. CGL-2 wird von Säugetierzellen unkonventionell exportiert, wobei dieser Prozess von der Bindung an β-Galaktosid-haltige Zelloberflächenrezeptoren abhängt. Die beschriebenen Arbeiten haben somit gezeigt, dass das primäre Sortierungssignal für die unkonventionelle Sekretion von Galectin-1 durch die β-Galaktosid-Bindungsstelle definiert ist und haben weitreichende Implikationen für die weitere Analyse der Galectin-1 Exportmaschinerie.
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