Einführung rekombinant veränderter Newcastle Disease Viren als Vektoren für therapeutisch nutzbare Gene in der Tumortherapie
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Modifikation einer erfolgreichen Methode zur Erzeugung von Anti-Tumor-Immunantworten bei Krebspatienten. Diese sogenannte aktiv spezifische Immuntherapie (ASI) bedient sich der Vakzinierung mit lebenden, inaktivierten und durch Newcastle Disease Virus (NDV) infizierten patienteneigenen Tumorzellen. Die antitumoralen Effekte der etablierten NDV Ulster (NDV) basierten Tumorvakzine sollten in dieser Arbeit durch den Einsatz rekombinanter NDV Viren vom Stamm LaSota (NDFL(+)) und durch Integration therapeutischer Gene in deren Genom verbessert werden. Zwei neue virale Vektoren standen für diese Aufgabe zur Verfügung: NDFL(IL-2) trägt das Gen für humanes Interleukin-2 (IL-2), einem Wachstumsfaktor für T-Lymphozyten, und NDFL(GM-CSF) das Gen für humanen granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), der Einfluss auf antigen-präsentierende Zellen (APZ), wie z.B. Dendritische Zellen (DZ) hat. Es konnte gezeigt werden, dass Infektion mit NDFL(IL-2) oder NDFL(GM-CSF) in verschiedenen Tumorzellen zur Expression von biologisch aktivem IL-2 bzw. GM-CSF führt. Die Genexpression korrelierte mit der gemessenen Replikation der Viren in den einzelnen Zelllinien. Die verwendeten rekombinanten LaSota-Viren zeigten im Vergleich zu NDV Ulster eine gesteigerte Fähigkeit Immunzellen gegen den Tumor zu aktivieren. Es konnte ferner nachgewiesen werden, dass die rekombinanten Varianten NDFL(IL-2) und NDFL(GM-CSF) in einem neu etablierten in vitro Tumor-Neutralisations-Assay (TNA) stärkere antitumorale Wirkungen entfalten als ihr Wildtyp NDFL(+). Diese verbesserte antitumorale Wirkung war nachweislich nicht auf Veränderungen von Eigenschaften im Bereich Bindung, Replikation, Tumorselektivität oder Reinfektion zurückzuführen. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass die LaSota-Viren im Vergleich zu NDV Ulster stärker Apoptose in den Vakzinezellen induzieren, was zu einer verstärkten Produktion von Onkolysaten und damit zu einer verbesserten Antigenpräsentation durch APZs führt. Verantwortlich dafür scheinen Gefahrensignale zu sein, die von virusinfizierten Onkolysaten ausgehen. Die Expression von GM-CSF durch NDFL(GM-CSF) führt zu einer zusätzlichen Verbesserung der ko-stimulatorischen Kapazitäten von DZ sowie zu ihrer Rekrutierung und Reifung. Außerdem führte der Kontakt mit NDV zu einer starken Expression von IFN-alpha; durch aufgereinigte, Toll Like Receptor (TLR) positive plasmazytoide Dendritische Zellen (PDZ). Es konnte weiter gezeigt werden, dass NDFL(+) infizierte Vakzinezellen zur besseren Aktivierung von CD14+ Monozyten und im Vergleich zu NDV Ulster, zu einer stärkeren Expression von TNF related apoptosis inducing ligand (TRAIL) führen, was teilweise die Begründung für die gesteigerte antitumoralen Wirkung von NDFL(+) darstellen könnte. NDFL(+) infizierte Vakzinezellen führen bei aufgereinigten NK-Zellen zur Aktivierung, die im Fall einer NDFL(IL-2)- oder NDFL(GM-CSF)-Infektion weiter gesteigert werden kann. Außerdem sind nur NDFL(IL-2) infizierte Vakzinezellen in der Lage CD8+ T-Zellen zu aktivieren und zu Exozytose-Aktivität sowie zur Sekretion von IFN-gamma; anzuregen. Dieses IFN-gamma; scheint mit der gesteigerten TRAIL-Expression durch NDFL(IL-2) infizierte Vakzinezellen auf CD14+ Monozyten in Zusammenhang zu stehen. In einem autologen in vitro Assay, bestehend aus primären Tumorzellen und T-Zellen von zugehörigen Tumor-drainierenden Lymphknoten von HNO-Tumor-Patienten, waren nur die NDFL(IL-2) infizierten autologen Tumorzellen in der Lage vorhandene Memory-T-Zellen zur Produktion von IFN-gamma; anregen. Die Verwendung von autologen Tumorzellen scheint dabei für die Aktivierung im ELISpot-Assay unbedingt erforderlich zu sein. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass rekombinantes NDV als Vektor für die Einführung potentieller therapeutischer Gene in eine Lebendzell-Vakzine als sehr nützlich angesehen werden kann.
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