Advances in Two-Photon Fluorescence Microscopy for High-Resolution Anatomical and Functional Imaging of Cell Populations in the Intact Brain
Die Zwei-Photonen Mikroskopie hat die hochauflösende Untersuchung einzelner Zellen im Gehirn anästhesierter Tiere ermöglicht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Weiterentwicklung dieser Technik in Richtung Zellpopulationsstudien im Neokortex von freilaufenden Nagetieren. Insbesondere wurden zwei Miniaturmikroskope, basierend auf der Fluoreszenzanregung durch eine photonische Kristallfaser beziehungsweise durch ein kohärentes Faserbündel, entwickelt und deren Einsatzfähigkeit anhand von in vivo Messungen verifiziert. Eine sinnvolle biologische Anwendung dieser Mikroskope setzt jedoch geeignete Fluoreszenzfärbemethoden voraus. Daher wurden zudem Methoden zur Färbung dreier Zellpopulationen entwickelt. Insbesondere wurden Sindbis- und Lentiviren zum Transfer und der gerichteten Expression genetisch kodierter Fluoreszenzindikatoren in Neuronen eingesetzt. Weiterhin wurde eine Methode zur spezifischen Färbung von Astroglia entdeckt und die transgene Expression von fluoreszierenden Proteinen zur Mikrogliazellfärbung eingesetzt. Mit einem Standard-Zwei-Photonen Mikroskop konnte gezeigt werden, daß sich Neurone und Astroglia im adulten Gehirn morphologisch kaum verändern, während Mikrogliazellen ihre Gestalt dynamisch variieren und schnell auf lokale Hirnverletzungen reagieren. Zudem konnte die spezifische Kalziumdynamik von Neuronen und Astroglia im intakten Gehirn visualisiert werden. Diese Fortschritte im Bereich Miniaturisierung und Fluoreszenzfärbung lassen die optische Messung von verhaltensabhängiger Netzwerkaktivität möglich erscheinen.
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