Signaltransduktion der gamma-Protocadherine
Gamma-Protocadherine (gamma-pcdh), glykosilierte Typ I Transmembranproteine mit einer extrazellulären Domäne aus sechs Cadherin-artigen Modulen, sind vermutlich an Zelladhäsion beteiligt und in Säugetieren überlebensnotwendig. In der Maus gibt es 22 gamma-pcdh-Isoformen, deren Ektodomäne, Transmembrandomäne und ein kleiner Teil der intrazellulären Sequenz gemeinsam von variablen Exons mit eigenem Promotor kodiert werden. Am 3´- Ende dieses seriell angeordneten „Genklusters“ befinden sich drei, als konstante Region bezeichnete Exons, welche den Rest der zytoplasmatischen Sequenz, die invariante C-terminale Domäne (gamma-ICD), kodieren. Durch „cis-Splicen“ der von diesem „Genkluster“ erzeugten Primärtranskripte können auf diese Weise Isoformen exprimiert werden, die alle die gamma-ICD enthalten. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit funktionellen Aspekten der gamma-ICD. Es wurden gentechnisch veränderte Mäuse analysiert, welche nach Entfernung des konstanten Exon 1 (deltaC1) keine funktionelle gamma-ICD mehr exprimieren können. Die neonathal sterbenden, homozygoten deltaC1/deltaC1-Tiere zeigten einen nahezu vollständigen Verlust der Lokusexpression. In den überlebenden, heterozygoten + /deltaC1-Mäusen wurden vom verbleibenden, intakten Allel Expressionsstärken von 50% der Wildtypmengen erwartet. Der Abfall der Transkript- und Proteinmengen auf 25% relativ zum Wildtyp war deshalb auffällig. Auffällig war auch die in Populationen von Nervenzellen auf Schnitten von adultem Maushirn beobachtete, gamma-ICD-spezifische Färbung des Zellkerns. Dies lässt eine Funktion der gamma-ICD bei der Genregulation im Zellkern vermuten. Für weitere Analysen wurden daher einfachere Zellkultursysteme verwendet, in welchen verschiedene, rekombinante gamma-pcdh-Proteinvarianten transient exprimiert werden konnten. Zunächst wurde damit die intrazelluläre Verteilung der gamma-pcdh in COS-1 Zellen bestimmt. Immunofluoreszensfärbungen ergaben, dass die Verteilung der N- und C-terminalen gamma-pcdh-Domänen unterschiedlich war und dass sich -wie in Neuronen- das gamma-ICD enthaltende Fragment im Zellkern befand. Sowohl in transfizierten COS-1 Zellen, welche mit gamma-Sekretaseinhibitoren behandelt wurden, als auch in gamma-Sekretase-inaktiven PS1/2 K.O. Zellen fanden sich zwingende Belege für die Prozessierung der gamma-pcdh durch „Regulierte Intramembran Proteolyse“ (RIP). Die intrazelluläre Domäne wird offenbar durch die gamma-Sekretase freigesetzt und dann in den Zellkern importiert. Analysen der Transkript- und Proteinmengen von transient (myc)gamma-ICD überexprimierenden HEK-293 Zellen zeigten eine Expressionssteigerung der endogenen Lokusexpression. Über zunehmende Luziferaseintensitäten von Reportervektoren ließ sich auch eine (myc)gamma-ICD-vermittelte Aktivitätssteigerung mehrerer gamma-pcdh-Promotor ermitteln. Darüber hinaus ließ sich in SH-SY5Y Zellen durch die Hemmung der gamma-Sekretaseaktivität auch die endogene Menge an gamma-pcdh reduzieren, so dass die gamma-pcdh-Lokusexpression über RIP reguliert wird. Diese Ergebnisse beschreiben den ersten Signaltransduktionsweg der gamma-pcdh und identifizieren damit ein neues, wichtiges Substrat des gamma-Sekretasekomplexes. Letztendlich bietet dieser Signaltransduktionsweg auch eine attraktive Erklärungsmöglichkeit für die in heterozygoten + /deltaC1-Mäusen beobachtete Reduktion der gamma-pcdh-Transkript- und Proteinmengen.
Networked Digital Library of Theses and Dissertations